ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Duplex Tib soude pou eleman chimik endistri chimik, Defisi nan SPECC1L mennen nan ogmante estabilite nan jwenti spliced ​​ak redwi koule nan selil krèt neral kranyal.

Mèsi paske w vizite Nature.com.W ap itilize yon vèsyon navigatè ak sipò CSS limite.Pou pi bon eksperyans, nou rekòmande pou w sèvi ak yon navigatè ki ajou (oswa enfim mòd konpatibilite nan Internet Explorer).Anplis de sa, asire sipò kontinyèl, nou montre sit la san estil ak JavaScript.

ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Duplex Tib soude pou endistri chimik

Liaocheng Sihe SS materyèl co, Ltd.se yon manifakti dirijan ki espesyalize nan asye pur tiyo san pwoblèm, tib rkwit klere, tib san pwoblèm bobin elatriye.Yo nan lòd yo fasilite kliyan yo, nou te soude tiyo ak tib tou.Liaocheng Sihe SS materyèl co, Ltd.gen ekipman pwodiksyon ak tès ki pi avanse.Nou ka totalman satisfè egzijans ou yo.Dapre estanda trè estrikteman, tib ki pwodui pa nou toujou gen kòrèk tolerans OD ak WT.Kontwòl tolerans la se entèdi pou pwodwi estanda.Pwodwi nou yo toujou satisfè ak kliyan yo.Kliyan te achte pwodwi nou yo te kreye plis pwofi.
a) OD (Dyamèt Eksteryè): 3.18mm a 101.6mm
b) WT (Mi epesè): 0.5mm a 20mm
c) Longè: Dapre kondisyon kliyan an
d) Estanda: ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 elatriye
e) Metòd Pwosesis: ERW, EFW elatriye

Koulis ki montre twa atik pou chak glisad.Sèvi ak bouton dèyè yo ak bouton kap vini yo pou w deplase nan glisad yo, oswa bouton kontwolè glisad yo nan fen pou deplase nan chak glisad.
Selil krèt neral kranyal yo (CNCC) retire pli neral anbriyon yo epi imigre nan ark farinj yo, ki fòme pi fò nan estrikti midface yo.Malfonksyònman CNCC jwe yon wòl enpòtan nan etyoloji nan fant orofasyal, yon malformation komen konjenital.Mitasyon eterozigòt SPECC1L yo te jwenn nan pasyan ki gen fant atipik ak sendwòm.Isit la, nou rapòte tach amelyore nan konpozan kanonik junction adezif (AJ), β-catenin ak E-cadherin nan kiltive selil knockdown SPECC1L, ak mikrografi elèktron montre difizyon apical-bazal nan AJ.Pou konprann wòl SPECC1L nan morphogenesis kranio-facial, nou te kreye yon modèl sourit Specc1l ensufizant.Mutant omozigot yo se anbriyon letal epi yo gen pwoblèm fèmti tib neral ak laminasyon CNCC.Tach pwoteyin AJ ogmante nan pli neral mutan yo.Defo AJ sa a konsistan avèk yon defo nan delaminasyon CNCC, ki egzije AJ yap divòse.Anplis de sa, mutan Specc11 te redwi siyal PI3K-AKT ak ogmante apoptoz.Nan vitro, anpèchman modere nan siyal PI3K-AKT nan selil sovaj yo te ase pou pwovoke chanjman AJ.Sa ki enpòtan, chanjman AJ pwovoke pa kraze SPECC1L ka ranvèse pa aktivasyon nan chemen an PI3K-AKT.Ansanm, done sa yo sijere ke SPECC1L, kòm yon regilatè roman nan siyal PI3K-AKT ak byoloji AJ, obligatwa pou fèmti tib neral ak stratifikasyon CNCC.
Selil krèt neral kranyal yo (CNCCs) lokalize nan neuroectoderm dorsal la epi detache soti nan neuroepithelium nan pliye neral yo devlope atravè yon pwosesis ki enplike tranzisyon epithelial-mesenchymal (EMT) 1,2,3.CNCC epitelyal premigrasyon deranje jonksyon entèselilè epi yo vin CNCC mesenchymal migran ki ranpli premye ak dezyèm ark farinj yo epi fòme pi fò nan Cartilage kranio-facial la.Kidonk, jèn ki kontwole fonksyon CNCC yo souvan deranje nan etyoloji anomali konjenital kranyofasyal tankou fant orofasyal, ki pi souvan afekte 1/800 nesans nan peyi Etazini pou kont li.Youn nan defòmasyon konjenital yo8.
Delaminasyon CNCC a konyenside ak fèmti tib neral antérieure ant 8.5 ak 9.5 jou devlopman anbriyon nan sourit yo.Mutan nan yon kantite jèn sourit ki asosye ak fann orofasyal tou montre kèk fòm defo tib neral, ki gen ladan Irf69,10, Ghrl310, Cfl111, ak Pdgfrα12.Sepandan, pwosesis yo nan fèmti tib neral ak stratifikasyon CNCC ka konsidere kòm endepandan, kòm sourit la mutan Splotch (Pax3) montre domaj nan fèmti tib neral san okenn efè sou stratifikasyon CNCC oswa migrasyon 13,14.Modèl sourit adisyonèl ak defo nan diseksyon CNCC ak fèmti tib neral pral ede delimiter baz molekilè komen nan de pwosesis sa yo.
Izolasyon CNCC nan selil neuroepithelial mande pou yap divòse junctions adezif (AJs), ki konpoze de konplèks pwoteyin ki gen ladan, pami lòt moun, E-cadherin, β-catenin, α-E-catenin, ak α-aktinin ki asosye ak filaman aktin 2. Etid ekspresyon E-cadherin nan pli neral te montre yon rediksyon oswa reta nan delaminasyon CNCC.Kontrèman, repwesyon E-cadherin rezilta nan stratifikasyon bonè15,16.Anpil nan faktè ki medyatè EMT pandan stratifikasyon CNCC yo se faktè transkripsyon (AP2α, Id2, FOXD3, kalmason, TWIST, SOX10) ak matrice ekstraselilè (ECM) remodeling pwoteyin tankou matris metalloproteinases (MMPs), sepandan CNCC yo se regilatè AJ cytoskeletal dirèk yo. poko konnen.Yo konnen chemen PI3K-AKT pou antagonize nivo E-cadherin, sitou nan rechèch kansè17.Dènye etid yo te montre ke pèt siyal PI3K-AKT ki baze sou PDGFα nan sourit mennen nan anomali kranyo-facial, ki gen ladan palè fann ak defo tib neral12.Sepandan, relasyon ki genyen ant chemen PI3K-AKT ak estabilite AJ sou stratifikasyon CNCC pa klè.
Nou te deja idantifye SPECC1L kòm premye jèn mutan nan de moun ki gen yon fann grav ki pwolonje soti nan bouch la rive nan je a, ke yo rekonèt kòm fann oblik (ObFC) oswa Tessier IV18 fann.Mitasyon SPECC1L yo te idantifye nan de fanmi miltijenerasyon ak sendwòm Opitz G/BBB otosomal dominan (OMIM #145410), kote moun ki afekte yo te ekspoze ipèrdistans ak lèv/palè fann19, ak nan yon fanmi ki gen sendwòm twòp distans Tibi (OMIM #145420)20. .plis pase mwatye nan ka sendwòm Opitz G/BBB yo lye X (OMIM #300000) epi yo koze pa mitasyon nan jèn MID1 la, ki kode pwoteyin 22 nan skelèt selil ki asosye ak mikrotubule.Nou ipotèz ke SPECC1L, tou yon pwoteyin ki asosye ak mikrotubul ak sitoskelèt aktin, ka medyatè siyal ki nesesè pou renovasyon sitoskelèt aktin pandan adhesion selil ak migrasyon 18.Atravè etid in vitro ak in vivo, kounye a nou dekri SPECC1L kòm yon regilatè roman estabilite AJ atravè siyal PI3K-AKT.Nan nivo selilè, deficiency SPECC1L te lakòz yon diminisyon nan nivo pwoteyin pan-AKT ak yon ogmantasyon nan dispèsyon apical-bazal AJ, ki te elimine pa deklanchman chimik nan chemen AKT la.Nan vivo, Specc11-defisyan anbriyon montre gen pwoblèm fèmen tib neral ak redwi diseksyon CNCC.Kidonk, SPECC1L fonksyone nan siyal ki baze sou adezyon selil ki trè reglemante ki nesesè pou fonksyon nòmal CNCC pandan morfogenesis feminen.
Pou karakterize wòl SPECC1L nan nivo selilè, nou te itilize liy selil osteosarcoma ki dekri deja U2OS ki ensufizant nan SPECC1L18.Selil U2OS ki estab sa yo ak kraze SPECC1L (kd) te gen yon diminisyon modere (60-70%) nan nivo transkripsyon SPECC1L ak pwoteyin, ansanm ak defo nan migrasyon ak reòganizasyon sitoskelèt aktin 18. Kontrèman, yon diminisyon grav pasajè nan SPECC1L te montre pou mennen a défauts mitotic 23 .Apre plis karakterizasyon, nou te jwenn ke selil ki estab SPECC1L-kd nou yo chanje mòfoloji nan yon degre trè wo nan konfluans (Figi 1).Selil kontwòl endividyèl ak selil kd nan konfluans ki ba yo te sanble menm jan an (Figi 1A, D).24 èdtan apre fizyon, selil kontwòl kenbe fòm kib yo (Fig. 1B, E), pandan y ap selil SPECC1L-kd long (Fig. 1C, F).Kantite chanjman sa a nan fòm selil yo te kaptire pa in vivo D vivan nan selil kontwòl ak selil kd (fim 1).Pou detèmine wòl SPECC1L nan selil konfluan, nou premye egzamine ekspresyon li yo.Nou te jwenn ke nivo pwoteyin SPECC1L ogmante lè fizyon (Figi 1G), tandiske nivo transkripsyon SPECC1L pa t ogmante (Figi 1H).Anplis de sa, kòm dansite selil ogmante, SPECC1L pwoteyin akimile nan fwontyè entèselilè (Fig. 2A-E), ak yon modèl sipèpoze ak sa yo ki nan manbràn ki asosye β-catenin (Fig. 2A'-E').Bay asosyasyon an nan SPECC1L ak cytoskeleton nan actin 18,23 nou ipotèz ke SPECC1L reyaji ak junctions adezif ki baze sou aktin (AJ).
(AF) SPECC1L knockdown (DF) selil alonje nan gwo konfluans (F) konpare ak kontwòl selil U2OS (AC).Men twa nan sis pwen tan yo (T1, T3, T6) ke nou te chwazi pou diferan dansite selil yo.(G) analiz Western blot ki montre ke pwoteyin SPECC1L la estabilize nan yon wo degre de konfluans konpare ak yon degre ki ba nan konfluyans nan selil kontwòl.Western blot nan SPECC1L montre gwoup la espere 120 kDa ak yon gwoup pwa molekilè ki pi wo, petèt apre-tradiksyon modifye (*).Western blot analiz te fèt nan menm kondisyon yo pou konfluans ba ak segondè.Imaj ki montre SPECC1L nan konfluans ki ba ak segondè yo te pran nan menm tach la.Yo te retire menm blot la epi yo te re-ekzamine ak antikò β-aktin.(H) Analiz RT-PCR quantitative pa montre okenn chanjman enpòtan nan nivo transkripsyon SPECC1L yo.Ba erè reprezante SEM soti nan kat eksperyans endepandan.
(AE) Nou te chwazi sis pwen tan (T1-T6) ki reprezante yon seri dansite selil pou nòmalize analiz fòm selil yo ak chanjman AJ nan selil U2OS ak SPECC1L knockdown (kd).Premye senk nan pwen tan sa yo enkli selil sèl (T1), 50-70% fizyon ti grap selil (T2), fizyon san yo pa refòm selil kd (T3), refòm selil kd (T4), ak chanjman 24 èdtan.nan fòm dèyè selil kd (T5).Pwoteyin SPECC1L la te gaye sitou nan sitoplasm nan T1 (A), men yo te obsève akimilasyon li nan limit entèselilè nan pwen tan ki vin apre yo (B-E, flèch).(FJ) β-catenin montre akimilasyon menm jan an nan fwontyè entèselilè ki asosye ak konplèks AJ la.(A'-E') SPECC1L ak β-catenin montre sipèpoze tach nan fwontyè selil yo nan dansite selil segondè (flèch).(F'-J') Nan selil SPECC1L-kd, tach β-catenin parèt nòmal nan dansite selil ki ba (F'-H'), men elaji kòm fòm selil chanje (I', J'; flèch), ki endike ke AJ te chanje.Ba = 10 µm.
Lè sa a, nou te eseye detèmine efè a nan deficiency SPECC1L sou AJ.Nou itilize plizyè makè ki asosye ak AJ, ki gen ladan konpozan kanonik F-aktin, myosin IIb, β-catenin, ak E-cadherin24,25,26,27.Fib estrès Actin ogmante nan selil SPECC1L-kd jan sa dekri deja (Fig. 3A, B) 18 .Myosin IIb ki asosye ak filaman aktin te montre yon ogmantasyon menm jan an nan selil SPECC1L-kd nan vitro (figi 3C, D).AJ-asosye β-catenin mare nan kadherin nan manbràn selilè a, ki montre yon modèl ekspresyon nòmal "siwo myèl" nan kibosit kontwòl (Fig. 3E, G).Enteresan, nan imaj plat lè l sèvi avèk mikwoskospi konfokal, β-catenin (Fig. 3E, F) ak E-cadherin (Fig. 3G, H) tach sou manbràn selilè nan konfluent SPECC1L-defisyan selil te montre modèl enpòtan nan tach pwolonje.Ekspansyon sa a nan AJ-asosye tach β-catenin nan selil kd te pi pwononse nan konfluans, men te parèt anvan chanjman nan fòm selil (figi 2F-J, F'-J').Pou detèmine nati fizik tach AJ pwolonje sa a, nou egzamine fwontyè selil yo sou sifas apical-bazal selil SPECC1L-kd U2OS pa mikwoskospi elektwonik transmisyon (TEM) (Figi 3I, J).Kontrèman ak selil kontwòl (Fig. 3I), ki te gen rejyon separe elèktron dans indicative de AJ (flèch), selil kd (Fig. 3J) te montre gwo, rejyon vwazen nan dansite elèktron segondè indicative de AJ sou plan apicobasal la..Anplis de sa, sou seksyon transverse, nou obsève anpil pliye manbràn selilè nan selil kd (Fig. S1A, B), ki eksplike modèl la pwolonje nan β-catenin ak E-cadherin tach gwoup (Fig. 3F, H).Nan sipò nan wòl nan SPECC1L nan AJs, β-catenin te ko-immunoprecipitated ak SPECC1L nan lysates nan selil U2OS konfluan (Fig. 3K).Ansanm ak imunostaining pwolonje pou makè AJ, analiz TEM te konsistan avèk ipotèz nou an ke deficiency SPECC1L ogmante dansite AJ apik-bazal ak divèjans.
(AH) Ogmantasyon tach F-aktin nan selil kd nan 48 èdtan apre fizyon (T6; A, B).Chanje tach nan myosin IIb ki asosye ak F-aktin (C, D).Modèl la lis nan β-catenin ak E-cadherin tach manbràn nan selil kontwòl (E, G) te amelyore nan selil SPECC1L-kd (F, H).Ba = 10 µm.(I–J) Mikrograf elèktron obsève junction entèselilè apik-bazal.Selil kontwòl yo montre rejyon diferan elektwon-dans ki endike junctions kolan (I, flèch).Kontrèman, tout junction apical-bazal nan selil SPECC1L-kd parèt elèktron dans (J, flèch), ki endike ogmante dansite ak dispèsyon junctions adezif.(K) β-catenin te ko-immunoprecipitated ak SPECC1L nan lysates selil U2OS konfluan.Imaj yo pran nan yon kote ki reprezante youn nan kat eksperyans endepandan.
Pou konprann wòl SPECC1L nan morphogenesis kraniofacial, nou te kreye yon modèl sourit Specc1l ensufizant lè l sèvi avèk de liy selil endepandan ES pèlen, DTM096 ak RRH048 (BayGenomics, CA), ki reprezante entron 1 ak transkripsyon Specc1l yo te kaptire nan 15 (Fig. 1) .4A, figi S2).Kote jenomik insert vektè dekoy la te detèmine pa sekans genomic antye ak konfime pa PCR (Fig. S2).Tou de konsepsyon pèlen jèn yo te pèmèt tou fizyon nan ankadreman repòtè Specc11-lacZ yo lè yo te kaptire yo.Se poutèt sa, ekspresyon lacZ detèmine pa tach X-gal te itilize kòm yon endikatè nan ekspresyon Specc11.Tou de alèl yo te montre menm modèl ekspresyon lacZ, ak pèlen jèn DTM096 nan entron 1 ki montre ekspresyon pi fò pase RRH048 nan entron 15 (pa montre).Sepandan, Specc1l eksprime lajman, ak ekspresyon patikilyèman fò nan pli neral yo nan E8.5 (Figi 4B), nan tib neral la ak pwosesis feminen nan E9.5 ak E10.5 (Figi 4C, D), ak nan devlope manm. nan E10.5 ak je (Figi 4D).Nou te deja rapòte ke ekspresyon SPECC1L nan premye ark farinj lan nan E10.5 te prezan nan epitelyal la ak mesenchyme18 kache, ki konsistan avèk liy lan CNCC.Pou teste ekspresyon SPECC1L nan CNCC, nou te fè E8.5 pli neral (Figi 4E-J) ak seksyon zo bwa tèt E9.5 (Figi 4K-).Nan E8.5, SPECC1L tache pli neral intans (Fig. 4E, H), ki gen ladan selil tache ak makè NCC (Fig. 4G, J).Nan E9.5, SPECC1L (Fig. 4K, N) fòtman tache migrasyon CNCC ko-tache ak AP2A (Fig. 4L, M) oswa SOX10 (Fig. 4O, P).
(A) Reprezantasyon eskematik jèn Specc11 sourit ki montre ensèsyon vektè dekou nan ES DTM096 (intron 1) ak klonaj selil RRH048 (intron 15).(BD) tach lacZ nan anbriyon eterozigot Specc1lDTM096 ki reprezante ekspresyon Specc1l soti nan E8.5 a E10.5.NE = neuroectoderm, NF = pli neral, PA1 = premye ark farinj.(EP) SPECC1L immunostaining ak makè NCC AP2A ak SOX10 nan pli neral E8.5 (NF; EJ) ak seksyon zo bwa tèt E9.5 (KP).SPECC1L tach te lajman obsève nan pli neral E8.5 (E, H; pwen flèch), ki gen ladan selil ki make ak AP2A (F, G; pwen flèch) ak SOX10 (I, J; pwen flèch).Nan E9.5, SPECC1L fòtman tache migrasyon CNCCs (K, N; flèch) ki make AP2A (L, M; flèch) ak SOX10 (O, P; flèch).
Travèse ant eterozigòt Specc1lDTM096/+ ak Specc1lRRH048/+ sourit montre ke de alèl pèlen jèn yo pa konplemantè e ke eterozigòt konpoze ak omozigòt anbriyonè pou swa alèl pèlen jèn yo se anbriyon letal (Tablo S1).Rapò Mendelian yo endike yon diminisyon nan pousantaj siviv eterozigòt nan nesans (espere 1.34 vs 2.0).Nou te note mòtalite perinatal ki ba nan mitan eterozigòt, kèk te gen anomali kranio-facial (Fig. S3).Sepandan, penetrasyon ki ba nan fenotip kranio-facial perinatal sa yo fè li difisil pou etidye mekanis fizyolojik ki kache yo.Se poutèt sa, nou konsantre sou fenotip letal anbriyon nan mutan Specc11 omozigòt yo.
Pifò konpoze eterozigòt oswa omozigòt Specc1lDTM096/RRH048 anbriyon mutan pa t 'devlope apre E9.5-10.5 (figi 5A-D), epi tib neral la pa t fèmen anteryèman (figi 5B, D) epi pafwa fèmen dèyè (pa montre) ..Defo kranyal fèmen tib neral sa a te asosye ak majorite CNCC ki make DLX2 ki rete nan pli neral yo nan E10.5, ki endike pa gen okenn disseksyon (Figi 5A'-D').Pou detèmine si gwosè jeneral CNCC te redwi tou, nou te make liy CNCC ak GFP nan liy pèlen jèn nou yo ak Wnt1-Cre ak ROSAmTmG.Nou distribye klase GFP+ NCC ak GFP- (RFP+) ki pa NCC soti nan anbriyon antye.Nan E9.5, pwopòsyon CNCCs ki gen etikèt GFP ki gen fòm koule pa t chanje anpil ant WT ak anbriyon mutan (pa montre), ki endike spesifikasyon CNCC nòmal.Se poutèt sa, nou te ipotèz ke rezidyèl Wnt1-Cre ak DLX2 tach nan pliye neral ekspoze (Figi 5B ') te akòz kouch CNCC defo, pètèt akòz ogmante dansite oswa dispèsyon selil AJ, jan yo wè nan selil SPECC1L-kd.Nou itilize makè NCC SOX10, AP2A, ak DLX2 pou konfime prezans CNCC nan pli neral la (Figi 5E-R).Nan E8.5, tach pliye neral pou tout twa makè NCC yo te obsève nan seksyon WT (Fig. 5E, G, I) ak Specc1l mutan (Fig. 5F, H, J).Nan E9.5, pandan y ap makè NCC tache migrasyon NCC nan seksyon WT (Fig. 5M, O, Q), yo te obsève tach rezidyèl NCC nan pliye neral ekspoze nan Specc1l anbriyon mutan (Fig. 5N, P, R).Paske SOX10 ak DLX2 make CNCCs migrasyon yo, rezilta sa a sijere ke CNCS SPECC1L-defisyan reyalize spesifikasyon apre migrasyon men yo pa imigre soti nan pli neral.
Defisyans Specc11 mennen nan fèmen tib neral ki defektye, delaminasyon nan selil krèt neral kranyal ak AJ yo.
(A, B') E9.5 WT (A) Anbriyon ki pote selil krèt neral kranyal yo (CNCC) ki make ak Wnt1-Cre (A').Kontrèman, Specc11 anbriyon mutan montre pli neral louvri (B), pwen flèch) ak CNCCs ki pa te imigre (B', pwen flèch).(C, D') Imaj jaden klere (C, D') ak imunostaining (C', D') nan makè CNCC DLX2 nan anbriyon E10.5 WT (C, C') ak Specc1l (D, D').Nan anbriyon WT E10.5, DLX2-pozitif CNCC kolonize ark branch yo (C', flèch), pandan ke nan mutan, tach evidan pèsiste nan pli neral yo louvri (D', flèch) ak nan premye ark farinj yo (D', flèch).) ak kèk tach (flèch) ki endike pòv delaminasyon ak migrasyon nan CNCC.ER) Seksyon anbriyon mutan WT ak Specc1l nan etap E8.5 (E-L) ak E9.5 (M-R) yo te make ak makè NCC SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P) ak DLX2 (I, J, Q, R).Nan E8.5, yo te obsève tach NCC nan pliye neral sovaj (NF) ak seksyon mutan.Ko-tach SOX10 ak β-catenin nan E8.5 WT (K) ak mutan (L) revele ogmante tach β-catenin nan limit selil yo nan pli neral yo.Nan E9.5, yo te obsève tach sovaj nan CNCCs migrasyon (M, O, Q), pandan ke yo nan mutan, CNCCs unstratified tache pli ouvè neral (N, P, R).(S-Z) Analiz etikèt AJ in vivo nan seksyon coronal nan anbriyon WT ak Specc11DTM096/RRH048 ak mitasyon E9.5 la.Yo montre yon plan seksyon apwoksimatif nan kwen anwo dwat.Nan seksyon tisi mutan yo, yo te obsève ogmante tach F-aktin (S, T) ak myosin IIb (U, V).Menm jan ak rezilta yo nan vitro nan Fig. 3, nan anbriyon mutan, yo te obsève tach manbràn amelyore pou β-catenin (W, X) ak E-cadherin (Y, Z).(AA-BB) Yon mikwograf elèktron nan yon seksyon nan anbriyon sovaj ki gade pi lwen pase fwontyè selil apikal-bazal la montre yon rejyon distenk elektwon-dans ki endike jonksyon adezif (AA, flèch).Kontrèman, nan seksyon Specc11 anbriyon mutan (BB, flèch), tout junction apicobasal la se elektwon dans, ki endike yon dansite ogmante ak dispèsyon nan junctions adezif.
Pou teste ipotèz nou an ke kouch redwi se akòz chanjman AJ, nou egzamine etikèt AJ nan pliye neral ekspoze nan anbriyon mutan Specc1l (Fig. 5S-Z).Nou te obsève yon ogmantasyon nan fib estrès aktin (Fig. 5S, T) ak yon lokalizasyon koncomitan ogmante nan myosin IIB tach sou fib aktin (Fig. 5U, V).Sa ki enpòtan, nou te obsève ogmante tach nan β-catenin (Fig. 5W, X) ak E-cadherin (Fig. 5Y, Z) nan limit entèselilè.Nou menm tou nou egzamine tach β-catenin nan NCC nan pli neral yo nan anbriyon E8.5 (figi 5K, L).Tach β-catenin parèt pi fò nan pliye neral Specc1l mutan (figi 5L ak K), sijere ke chanjman AJ yo te kòmanse.Nan mikrograf elèktron nan seksyon zo bwa tèt nan anbriyon E9.5, nou ankò obsève ogmante tach difize elektwon-dans nan Specc1l anbriyon mutan konpare ak WT (Fig. 5AA, BB ak S1E-H).Ansanm, rezilta sa yo sipòte rezilta in vitro nou yo nan selil SPECC1L-kd U2OS epi sijere ke tach AJ aberan anvan stratifikasyon CNCC nan anbriyon mutan nou yo.
Bay relasyon antagonis li te ye ant aktivite AKT ak estabilite E-cadherin, 17,28 nou ipotèz patisipasyon siyal PI3K-AKT.Anplis de sa, nou te obsève ti anpoul subepiderm nan kèk nan anbriyon mutan nou yo ki te chape anba letalite (<5%) nan E9.5-10.5 epi olye yo te etabli nan alantou E13.5 (Fig. S3).Vesikil subepidermal yo se yon mak nan siyal PI3K-AKT redwi ki baze sou PDGFRα12.Fantauzzo et al.(2014) rapòte ke dezòd nan deklanchman PI3K ki baze sou PDGFRα nan anbriyon mutan PdgfraPI3K/PI3K rezilta nan vesik subepiderm, defo tib neral, ak fenotip palè fann.Vreman vre, nivo pan-AKT ak aktif fosforilasyon Ser473-AKT yo te redwi nan vivo nan tisi mutan Specc1l nan arestasyon anbriyon E9.5 (Fig. 6A-D).Diminisyon nan nivo fosforilasyon Ser473-AKT ka antyèman akòz diminisyon nan nivo pan-AKT nan vivo (FIG. 6E) ak nan vitro (FIG. 6F).Yo te obsève yon diminisyon in vitro sèlman lè selil U2OS yo te fòtman konfluan ak chanjman nan fòm selil ak dansite AJ (Figi 6D).Kidonk, done nou yo sijere ke SPECC1L se yon nouvo regilatè pozitif nan siyal PI3K-AKT nan morfogenesis kraniofacial.
(A–E) E8.5 (A,B) ak E9.5 (C,D) seksyon zo bwa tèt oswa E9.5 lysates soti nan Specc1l anbriyon mutan (E) ki montre nivo fosforilasyon aktif S473-AKT ak pan-AKT rediksyon pwoteyin , konpare ak kontwòl WT.Western blotting te fèt sou lysates kalite sovaj ak lysates mutan nan menm kondisyon yo.Imaj yo montre pou SPECC1L yo te pran nan yon sèl blot.Yo te retire menm blot la epi yo te re-ekzamine ak anti-pan-ACT ak antikò β-aktin.Nivo Pan-AKT nan pli neral E8.5 (A, B) ak nivo fosforilasyon S473-AKT nan seksyon zo bwa tèt E9.5 yo te siyifikativman redwi.(F) Nivo Pan-AKT yo te redwi menm jan an nan lysates nan selil SPECC1L-kd U2OS rekòlte nan gwo konfluans.Ba erè reprezante SEM ki soti nan twa kantite Western blot endepandan.(GJ) Seksyon nan anbriyon WT nan E9.5 tache ak KI67 ak cleaved caspase 3, respektivman, ki montre pwopagasyon selil (G, G') ak ti aktivite apoptotik (H, H').Specc11 anbriyon mutan montre pwopagasyon selil konparab (I), men kantite selil ki sibi apoptoz ogmante siyifikativman (J).
Lè sa a, nou te egzamine makè pwopagasyon ak apoptoz.Nou pa t 'obsève okenn diferans nan pwopagasyon anbriyon E9.5 (figi 6E, G konpare ak I) ak yon endèks pwopagasyon 82.5% pou mutan WT ak 86.5% pou mutan Specc1l mezire pa tach KI67 (p <0.56, Fisher a. tès egzak).Menm jan an tou, nou pa t 'obsève okenn diferans nan apoptoz mezire pa tach pou kaspase cleaved 3 nan pli neral nan E8.5 jiskaske arestasyon anbriyon (pa montre) (pa montre).Kontrèman, apoptoz te siyifikativman ogmante nan tout anbriyon mutan E9.5 (figi 6F, H ak J).Ogmantasyon jeneral sa a nan apoptoz konsistan avèk siyal PI3K-AKT redwi ak letalite anbriyon bonè29,30,31.
Apre sa, konfime yon wòl kozatif pou siyal PI3K-AKT nan chanjman AJ nan selil kd nou yo, nou chanje chimikman chemen an nan kontwòl ak selil kd (Figi 7A-F).Nou te itilize kòm yon makè fenotip chanjman fòm selil yo obsève nan selil SPECC1L-kd konfluan, ke nou te mezire lè l sèvi avèk rapò ki pi long dimansyon (longè) ak dimansyon vètikal ki koresponn lan (lajè).Yo espere yon rapò 1 pou selil relativman wonn oswa kib (Figi 7G).Anplis fòm selil, nou konfime tou efè a sou AJ pa tach β-catenin (figi 7A'-F').Anpèchman nan chemen an PI3K-AKT lè l sèvi avèk wortmannin te ase chanje fòm selil nan selil kontwòl (Figi 7A, C) ak AJ (Figi 7A ').PI3K-AKT activator SC-79 pa t afekte fòm selil (FIG. 7A, E) oswa AJ ekspansyon (FIG. 7A') nan selil kontwòl yo.Nan selil SPECC1L-kd, plis repwesyon nan chemen an PI3K-AKT te lakòz ogmante apoptoz (Fig. 7B, D) ak yon ogmantasyon make nan tach β-catenin (Fig. 7B '), ki konsistan avèk mutan lou in vivo nou an.Sa ki enpòtan, aktivasyon chemen PI3K-AKT amelyore fòm selil (Figi 7B, F) ak fenotip AJ (Figi 7B).Chanjman nan fòm selil yo te quantifye kòm rapò roundness selil (CCR) ak konpare pou siyifikasyon jan sa dekri pi wo a (FIG. 7G).Vreman vre, nan selil kontwòl (figi 7G, CCR = 1.56), tretman wortmannin te ase pou chanje fòm selil la (figi 7G, CCR = 3.61, p <2.4 × 10-9) nan limit ki sanble ak yon sèl la obsève. nan SPECC1L.-kd selil (figi 7G, CCR = 3.46).Wortmannin tretman nan selil SPECC1L-kd (figi 7G, CCR = 3.60, neglijab) pa te pi enpòtan pase selil kd ki pa trete (figi 7G, CCR = 3.46, neglijab) oswa wortmannin-trete selil kontwòl (figi 7G)., CCR = 3.46, neglijab) Anplis de sa afekte elongasyon selil (7G, CCR = 3.61, neglijab).Sa ki pi enpòtan, SC-79 AKT activator retabli fenotip long nan selil SPECC1L-kd (figi 7G, CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12).Rezilta sa yo konfime ke SPECC1L kontwole siyal PI3K-AKT epi sijere ke yon diminisyon modere nan SPECC1L afekte adezyon selilè, pandan y ap yon diminisyon fò mennen nan apoptoz (Fig. 8).
(A–F') Kontwòl (A, C, E) ak SPECC1L-kd (B, D, F) selil trete ak wortmannin inhibitor chemen PI3K-AKT (C, D) oswa SC-79 activator (E, F) Tretman .Selil kontwòl ki pa trete yo se kib (A) ak nòmal β-chat tach selilè (A'), pandan y ap selil kd yo long (B) ak ogmante tach β-chat (B').Apre repwesyon nan chemen PI3K-AKT, selil kontwòl alonje (C) ak ekspansyon β-chat (C'), pandan y ap selil kd yo te kòmanse sibi apoptoz (D), menm jan ak anbriyon trè mitasyon nou yo epi ki montre β-chat trè amelyore.tach (D').Apre deklanchman chemen PI3K-AKT, selil kontwòl yo te rete kib (E) epi yo te gen tach nòmal β-chat (E'), pandan y ap selil kd yo te montre siyifikativman amelyore fòm selil (F) ak tach β-chat (F'), ki endike (G) Degre chanjman fòm selil yo nan (AF) te quantifye lè l sèvi avèk rapò roundness selil (CCR) nan dimansyon ki pi long (longè) ak dimansyon vètikal ki koresponn lan (lajè) lè l sèvi avèk lojisyèl MetaMorph.Selil SPECC1L-kd ki pa trete (NT) (CCR = 3.46) yo te siyifikativman pi long pase selil kontwòl (CCR = 1.56, p <6.1 × 10-13).Anpèchman Wort nan chemen an PI3K-AKT nan selil kontwòl te ase pou lakòz yon elongasyon menm jan an nan fòm selil (CCR = 3.61, p <2.4 × 10-9).Menm jan an tou, aktivasyon AKT pa SC-79 nan selil SPECC1L-kd retabli elongasyon selilè nan nivo kontwòl (CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12).Wortmannin tretman nan selil SPECC1L-kd te lakòz ogmante apoptoz men pa gen okenn ogmantasyon plis nan chanjman fòm selil (CCR = 3.60) konpare ak kd ki pa trete (CCR = 3.46, ns) oswa wortmannin-trete selil kontwòl (3.61) obsève nan.ns = pa gen pwoblèm.+/- Mezi SEM pou 50 selil yo montre.Diferans estatistik yo te kalkile lè l sèvi avèk tès t Elèv la.
(A) Reprezantasyon chematik nan anpèchman ak aktivasyon nan chemen an PI3K-AKT ki lakòz chanjman AJ ak sekou, respektivman.(B) Pwopoze modèl pou estabilizasyon pwoteyin AKT pa SPECC1L.
CNCC premigratwa yo mande pou AJ lysis separe de selil neuroepitelial pliye neral anteryè1,15,32.Ogmante tach nan konpozan AJ ak pèt distribisyon asimetri AJ apical-bazal nan selil SPECC1L-defisyan tou de nan vitro ak nan vivo, konbine avèk pwoksimite fizik SPECC1L nan β-catenin, sijere ke SPECC1L fonksyone byen kenbe estabilite lokal AJ pou misk òganizasyon.aktin sitoskelèt.Asosyasyon SPECC1L ak cytoskeleton aktin ak β-catenin ak ogmantasyon nan kantite filaman aktin kondanse nan absans SPECC1L ki konsistan avèk ogmantasyon obsève nan dansite AJ.Yon lòt posibilite se ke yon kantite ogmante nan fib aktin nan selil SPECC1L-ensufizant mennen nan yon chanjman nan tansyon entèselilè.Paske estrès selilè afekte dinamik AJ 33, chanjman vòltaj ka lakòz plis difize AJ 34.Se konsa, nenpòt chanjman pral afekte kouch CNCC yo.
Wnt1 eksprime nan pli bonè neral yo ki bay monte selil krèt neral yo.Kidonk, trase liyaj Wnt1-cre make tou de NCC35 anvan ak migrasyon.Sepandan, Wnt1 make tou klon tisi nan sèvo dorsal tou sòti nan pli bonè neral 35,36, ki fè li posib ke tach nou an nan mutan E9.5 pou makè Wnt1 nan pli neral louvri se pa CNCC.Tach pozitif nou an pou makè NCC AP2A ak SOX10 konfime ke pliye neral ekspoze nan anbriyon mutan Specc11 yo te genyen tout bon CNCC.Anplis de sa, depi AP2A ak SOX10 se makè NCC migrasyon bonè, tach pozitif endike ke selil sa yo se CNCC post-migrasyon ki pa ka stratifye pa E9.5.
Done nou yo sijere ke règleman molekilè AJ pa SPECC1L medyatè pa siyal PI3K-AKT.Siyal AKT redwi nan selil SPECC1L ak tisi ki ensufizant yo.Konklizyon pa Fantauzzo et al.sipòte yon wòl dirèk pou siyal PI3K-AKT nan morphogenesis kranio-facial.(2014) te montre ke mank de aktivasyon siyal PI3K-AKT ki baze sou PDGFRα mennen nan yon fenotip palè fann.Nou montre tou ke anpèchman chemen PI3K-AKT a ase pou chanje fòm AJ ak selil nan selil U2OS yo.Konfòm ak rezilta nou yo, Cain et al.37 te montre ke downregulation nan subunite PI3K α110 nan selil andothelial rezilta nan yon ogmantasyon menm jan an nan tach β-catenin pericellular, refere yo kòm yon ogmantasyon nan "endèks koneksyon an".Sepandan, nan selil andothelial ki gen filaman aktin yo deja trè òganize, sipresyon chemen PI3K-AKT la lakòz yon fòm selil ki lach.Kontrèman, selil SPECC1L-kd U2OS te montre yon fòm selil ki long.Diferans sa a ka espesifik kalite selil.Pandan ke repwesyon nan siyal PI3K-AKT pèmanan afekte sitoskelèt aktin, efè a sou fòm selil yo detèmine pa chanjman nan tansyon ki te koze pa chanjman nan dansite ak òganizasyon nan fib aktin santral.Nan selil U2OS, nou te itilize sèlman chanjman fòm selil kòm yon makè chanjman ak rekiperasyon AJ SPECC1L-defisyan.An konklizyon, nou ipotèz ke anpèchman nan chemen an AKT nan deficiency SPECC1L ogmante estabilite AJ ak diminye delaminasyon nan CNCC.
Enteresan, nivo pan-AKT yo te redwi nan vitro ak nan vivo anplis de fosforilasyon nivo 473-AKT nan absans SPECC1L, sijere règleman nan siyal PI3K-AKT nan nivo estabilite pwoteyin AKT oswa woulman.Jèn SPECC1L ak MID1, tou de ki asosye ak sendwòm Opitz/GBBB, kode pwoteyin ki estabilize mikrotubul 18,22.Mekanis nan ki SPECC1L ak MID1 medyatè estabilizasyon mikrotubule pa konprann konplètman.Nan ka a nan SPECC1L, estabilizasyon sa a gen ladan acetylation ranfòse nan yon ti gwoup mikrotubul 18 .Li posib ke SPECC1L sèvi ak yon mekanis ki sanble pou estabilize lòt pwoteyin tankou AKT.Li te montre ke asetilasyon nan résidus lizin nan pwoteyin AKT mennen nan yon diminisyon nan lokalizasyon manbràn ak fosforilasyon38.Anplis de sa, ubiquitination nan chèn K63 la nan menm rezidi lizin sou AKT obligatwa pou lokalizasyon manbràn li yo ak aktivasyon39,40.Pami plizyè faktè ki kominike avèk pwoteyin SPECC1L yo idantifye nan divès kalite ekran de-ibrid ledven gwo debi, kat - CCDC841, ECM2942, APC ak UBE2I43 - yo te enplike nan woulman pwoteyin oswa estabilite atravè ubiquitination oswa sumoylation.SPECC1L ka patisipe nan modifikasyon post-tradiksyon nan rezidi lizin AKT, ki afekte estabilite AKT.Sepandan, wòl enpòtan nan SPECC1L nan lokalizasyon ak estabilite nan pwoteyin AKT rete yo dwe klè.
Defo grav nan ekspresyon SPECC1L nan vivo te lakòz ogmante tach makè AJ ak defo CNCC kouvri, osi byen ke ogmante apoptoz ak letalite anbriyon bonè.Rapò anvan yo te montre ke mutan sourit ak nivo ogmante nan apoptoz yo asosye ak domaj tib neral 44,45,46,47 ak defo kranio-facial48.Li te sigjere ke lanmò selil twòp nan pli neral yo oswa ark farinj yo ka lakòz yon kantite ensifizan selil ki nesesè pou mouvman morfogenetik apwopriye 48,49,50.Kontrèman, liy selil SPECC1L ensufizant nou yo ak ekspresyon SPECC1L modere redwi te montre sèlman chanjman AJ san prèv ogmante lanmò selil.Sepandan, anpèchman chimik nan chemen PI3K-AKT nan selil Kd sa yo te lakòz ogmante apoptoz.Kidonk, yon diminisyon modere nan ekspresyon oswa fonksyon SPECC1L asire siviv selil yo.Sa a se ki konsistan avèk obsèvasyon an ki ra Specc11 anbriyon mutan ki chape anba arestasyon nan st.E9.5—petèt akòz redwi efikasite kaptire jèn—yo kapab fèmen tib neral yo epi yo sispann pita nan devlopman, souvan ak domaj kranyo-facial (Fig. S3).Epitou ki konsistan avèk sa a se ensidan an ra nan anbriyon Specc1l eterozigòt ak anomali kraniofasyal-pwobableman akòz ogmante efikasite kaptire jèn-ansanm ak konklizyon an nan pwason zèb nan ki youn nan de orthologue SPECC1L yo (specc1lb) lakòz fenotip anbriyon an reta, ki gen ladan pèt nan. machwè pi ba yo ak fann bilateral51.Kidonk, mitasyon pèt fonksyon eterozigòt SPECC1L yo idantifye nan pasyan imen yo ka lakòz ti andikap nan fonksyon SPECC1L pandan morfogenesis kraniofacial, ase pou eksplike fant orofasyal yo.Règleman ki baze sou SPECC1L nan kontak entèselilè ka jwe tou yon wòl nan palatogenesis ak fizyon ark farinj yo.Plis etid sou fonksyon SPECC1L pral ede elicide wòl tanporè kontak entèselilè nan CNCC pandan fèmen tib neral nan motilite selil neuroepitelial ak morfogenesis kraniofacial.
Kontwòl osteosarcoma U2OS ak selil SPECC1L-kd yo te dekri deja (Saadi et al., 2011).Antikò kont SPECC1L yo te karakterize tou deja (Saadi et al., 2011).Antikò anti-β-catenin (lapen; 1:1000; Santa Cruz, Dallas, TX) (sourit; 1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), myosin IIb (1:1000; Sigma-Aldrich, St. Louis ) , MO) ), E-cadherin (1:1000; Abkam, Cambridge, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Kolo.), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, San Diego , Kalifòni), DLX2 (1:1000; Abcam, Cambridge, MA), fosfo-Ser473-AKT (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA). ), KI67 (1:1000; Teknoloji siyal selilè, Danvers, MA), kaspase 3 (1:1000; Teknoloji siyal selilè, Danvers, MA) ak β-aktin (1:2500; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO ) te itilize jan sa dekri..Aktin filaman yo te tache ak Acti-tach rhodamine phalloidin (Cytoskeleton, Denver, Colorado).
Selil kontwòl U2OS ak selil SPECC1L-kd yo te kiltive nan DMEM estanda ki wo glikoz ki te konplete ak 10% serom fetis bovin (Life Technologies, Carlsbad, CA).Pou chanjman AJ, 2 x 105 selil yo te simen sou vè trete ak 0.1% jelatin porsin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ak obsève pou chanjman nan fòm selil.Selil yo te kolekte nan diferan pwen tan endike: 4 èdtan apre simen (t = 1), 24 èdtan apre simen (t = 2), konfluyans san chanjman nan fòm selil (t = 3), chanjman nan fòm selil (t = 4) , 24 h apre chanjman fòm selil (t = 5) ak 48 h apre chanjman fòm selil (t = 6) (Fig. 1, 2, 3).Pou modile chemen PI3K-AKT, selil yo te kiltive nan konsantrasyon ki endike yo ak wortmannin inibitè PI3K-AKT (TOCRIS Biosciences, Minneapolis, Minnesota) oswa SC-79 activateur (TOCRIS Biosciences, Minneapolis Adams, Minnesota).Mwayen ki gen pwodwi chimik yo te chanje chak jou.
Anrejistreman ankadreman-pa-ankadreman yo te fè sou kontwòl viv ak selil KD nan kondisyon kilti nòmal, ak imaj kontras faz yo te kolekte chak 10 minit pou 7 jou.Imaj yo te akeri lè l sèvi avèk yon mikwoskòp Leica DM IRB ki te kontwole ak òdinatè ki te ekipe ak yon etap mekanik ak yon objektif 10 × N-PLAN ki konekte ak yon kamera QImaging Retiga-SRV.Pandan D, kilti selil yo te kenbe nan 37 ° C nan yon atmosfè imid ak 5% CO2.
De liy selil ES pèlen jèn DTM096 ak RRH048 ki soti nan Rejyonal Mutant Mouse Resource Center (UC Davis, CA) yo te itilize pou jenere Specc11 liy sourit ki ensufizant, ki deziyen Specc1lgtDTM096 ak Specc1lgtRRH046.Yon ti tan, selil 129/REJ ES yo te enjekte nan blastosist C57BL6.Sourit gason chimerik ki kapab lakòz yo te elve ak sourit fi C57BL6 pou idantifye pitit ak kolorasyon rad agouti.Te prezans nan foure vektè pèlen jèn yo itilize pou idantifye eterozigòt.Sourit yo te kenbe sou yon background melanje nan 129/REJ; C57BL6.Kote sit ensèsyon vektè pèlen jenetik la konfime pa RT-PCR, sekans genòm, ak konpleman jenetik (figi siplemantè 1).Pou trase liy CNCC sourit doub eterozigot Specc1lGT yo, yo te travèse sourit ROSAmTmG (#007576) ak Wnt1-Cre (#003829) (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) pou pwodui alèl ROSAmTmG ak Wnt1-Cre nan Specc1l embryos.Tout eksperyans nan sourit yo te fèt dapre pwotokòl ki apwouve pa Komite Enstitisyonèl Swen ak Itilizasyon Animal nan University of Kansas Medical Center.
Anbriyon yo te fikse nan (1% fòmaldeyid, 0.2% glutaraldehyde, 2 mM MgCl2, 0.02% NP-40, 5 mM EGTA) pou 60 min nan tanperati chanm.Apre fikse nan solisyon tach X-gal (5 mM potasyòm ferricyanide, 5 mM potasyòm ferosyanid, 2 mM MgCl2, 0.01% deoxycholate sodyòm, 0.02% NP-40, 1 mg / ml X-gal) devlopman tach te fèt nan 37 ° C. .°C nan 1-6 èdtan.Anbriyon yo te post-fiks nan 4% PFA ak visualized.
Pou Western blotting, selil yo te lysed nan pasif lysis tanpon (Promega, Fitchburg, WI) complétée ak yon melanj de inhibiteurs HALT proteaz (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).Lysates yo te trete sou 12% polyacrylamide Mini-PROTEAN TGX pare-fè jèl (Bio-Rad, Hercules, CA) ak transfere nan Immobilon PVDF manbràn (EMD Millipore, Billerica, MA).Manbràn yo te bloke nan 5% lèt nan PBS ki gen 0.1% Tween.Antikò yo te enkube lannwit lan nan 4 ° C oswa pou yon èdtan nan tanperati chanm.Femto SuperSignal West ECL reyaktif (Thermo Scientific, Waltham, MA) te itilize pou jenerasyon siyal.Pou immunostaining, anbriyon yo te fiks lannwit lan nan 4% PFA / PBS epi yo te kriyoprezève.Cryosections tisi yo te bloke nan PBS ki gen 1% serom kabrit nòmal (Thermo Scientific, Waltham, MA) ak 0.1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ak Lè sa a, enkubasyon nan 4 ° C nan yon enkibatè pandan la. lannwit.ak antikò ak fliyoresan segondè antikò (1:1000) pou 1 èdtan nan 4 ° C.Seksyon tache yo te mete nan mwayen lò ProLong (Thermo Scientific, Waltham MA) ak imaj plat yo te jwenn lè l sèvi avèk yon mikwoskòp konfokal Leica TCS SPE.Chak imunostaining te fèt kòm twa eksperyans endepandan sou cirossections nan omwen de anbriyon mutan.Yo montre yon eksperyans reprezantatif.
Selil yo te enkube nan tanpon RIPA modifye (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1% NP-40, 130 mM NaCl, 10% gliserin, 2 mM EDTA, ak HALT inibitè proteaz (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) Yon ti tan, lysates te prepurified ak pwoteyin G pèl mayetik (Life Technologies, Carlsbad, CA) ak Lè sa a, enkube lannwit lan nan 4 ° C. ak anti-SPECC1L oswa IgG pwoteyin G pèl pwoteyin yo te itilize ekstrè SPECC1L ak Western blotting te fèt lè l sèvi avèk anti a. -β-catenin antikò ki dekri pi wo a Eksperyans ko-IP yo montre yo reprezante kat eksperyans endepandan.
Selil kiltive fiks oswa tisi anbriyon sourit yo te bay sant mikwoskopi elektwonik nan University of Kansas Medical Center.Yon ti tan, echantiyon yo te entegre nan rezin EMbed 812 (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA), polymerize lannwit lan nan 60 ° C, ak seksyon nan 80 nm lè l sèvi avèk yon ultramicrotome Leica UC7 ekipe ak yon lam dyaman.Seksyon yo te vizyalize lè l sèvi avèk yon mikwoskòp elèktron transmisyon JEOL JEM-1400 ekipe ak yon zam 100 kV Lab6.
Ki jan yo site atik sa a: Wilson, NR et al.Defisi nan SPECC1L mennen nan ogmante estabilite nan jwenti spliced ​​ak redwi delaminasyon nan selil krèt neral kranyal yo.syans la.6, 17735;doi:10.1038/srep17735 (2016).
Sent-Jean, J.-P.Endiksyon ak diferansyasyon krèt neral la.(Springer Syans + Biznis Media; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006).
Cordero, DR et al.Selil krèt neral kranyal an mouvman: wòl yo nan devlopman kranyo-facial.Ameriken Journal of Jenetik Medikal.Pati A 155A, 270–279, doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
Boland, RP Neurocristopathia: kwasans li yo ak devlopman sou 20 ane.Pedyat.patoloji.laboratwa.remèd.17, 1–25 (1997).
Mangold E., Ludwig KU ak Noten MM Breakthrough nan jenetik yo nan fant orofasyal.Tandans nan Medsin Molekilè 17, 725-733, doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
Minu, M. ak Riley, FM Mekanis molekilè nan migrasyon selil krèt neral kranyal ak modèl pandan devlopman kranio-facial.Devlopman 137, 2605–2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010).
Dixon, MJ, Marazita, ML, Beaty, TH ak Murray, JK Cleft lèv ak palè: konprann enfliyans jenetik ak anviwònman an.kòmantè natirèl.Jenetik 12, 167-178, doi: 10.1038/nrg2933 (2011).
Ingram, CR et al.Mòfogenesis nòmal nan po a, branch yo, ak rejyon kranyo-facial nan entèferon-regleman faktè-6 (Irf6)-defisi sourit.Genette nasyonal.38, 1335–1340, doi: 10.1038/ng1903 (2006).
Peyrard-Janvid, M. et al.Mitasyon dominan nan GRHL3 lakòz sendwòm van der Waord ak afekte devlopman peridèm oral la.Am J Hum Genet 94, 23-32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
Harris, MJ ak Juriloff, DM Mete ajou lis mutan sourit ki gen defo nan fèmti tib neral ak pwogrè nan direksyon pou yon konpreyansyon jenetik konplè sou fèmti tib neral la.Ankèt sou domaj nesans.Pati A, Teratoloji klinik ak molekilè 88, 653-669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Fantauzzo, KA & Soriano, P. PI3K-medyatè PDGFRalpha siyal kontwole siviv ak pwopagasyon nan devlopman skelèt atravè yon chemen p53-depandan entraselilè.Gene Development 28, 1005–1017, doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014).
Kopp, AJ, Green, ND ak Murdoch, JN Disheveled: Relasyon nan ekspansyon konvèjan ak fèmen tib neral.Tandans nan newoloji.26, 453-455, doi: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003).