347 Nerjaveèi asye mawonnen tib eleman chimik, Idantifikasyon nan nouvo entèferon-reponn moun leukocyte antigen-A (HLA-A) pwoteyin chaperon lè l sèvi avèk espektrometri mas kwaze (CLMS)

Mèsi paske w vizite Nature.com.W ap itilize yon vèsyon navigatè ak sipò CSS limite.Pou pi bon eksperyans, nou rekòmande pou w sèvi ak yon navigatè ki ajou (oswa enfim mòd konpatibilite nan Internet Explorer).Anplis de sa, asire sipò kontinyèl, nou montre sit la san estil ak JavaScript.
Koulis ki montre twa atik pou chak glisad.Sèvi ak bouton dèyè yo ak bouton kap vini yo pou w deplase nan glisad yo, oswa bouton kontwolè glisad yo nan fen pou deplase nan chak glisad.

Deskripsyon Product

Nerjaveèi asye 347L Bobin Tib, Steel Klas: SS347L

Sistèm siyal entèferon an pwovoke yon gwo repons cytokine nan yon pakèt siyal patojèn ak intrinsèques patolojik ki soti nan anviwònman an, sa ki lakòz endiksyon nan sous-ansanm nan pwoteyin entèferon-induzibl.Nou aplike DSS-medyatè kwa-lyen mas espektrometri (CLMS) pou detekte nouvo entèraksyon pwoteyin-pwoteyin nan domèn pwoteyin entèferon-induit.Anplis de sa nan pwoteyin entèferon-induzibl yo espere, nou menm tou nou idantifye nouvo adducts intermolecular ak intramolecular cross-linked nan pwoteyin kanonik entèferon-induire tankou MX1, USP18, OAS3, ak STAT1.Nou konsantre sou validation orthogonal nan yon seri nouvo rezo pwoteyin entèferon-induzibl ki te fòme pa pwoteyin HLA-A (H2BFS-HLA-A-HMGA1) lè l sèvi avèk ko-iminopresipasyon ak etid pi lwen yo lè l sèvi avèk modèl dinamik molekilè.Modélisation dinamik konformasyon konplèks pwoteyin yo te revele plizyè sit entèraksyon ki te reflete entèraksyon yo idantifye nan rezilta CLMS yo.Ansanm, nou prezante yon etid pilòt nan CLMS pou idantifye nouvo konplèks siyal ki pwovoke pa entèferon, epi gade pou pi devan pou itilizasyon pi laj CLMS pou idantifye nouvo dinamik entèraksyon pwoteyin nan mikroanvironman timè a.
Anvan yon repons iminitè adaptab kòmanse, sistèm defans natirèl lame a monte yon repons antimikwòb medyatè pa yon fanmi cytokin alfa-helikal ki sekrete yo rele entèferon (IFN).Klas IFN tip I IFNα ak IFNβ aktive repons selilè, ki gen ladan eta antiviral, proapoptotik, proenflamatwa ak antiproliferatif.Nan imen, yo konnen 13 subtip IFNα, tout gwoupe sou kwomozòm 91. Etonan, sèlman IFNα2 te etidye pou itilizasyon klinik.Dènyèman, yo te peye atansyon espesyal nan rechèch sou lòt subtip IFNα.Yon etid resan te montre ke IFNα14 se youn nan izoform ki pi efikas nan mete restriksyon sou replikasyon HBV2 ak VIH-13,4 konpare ak subtip IFNα2 kanon.
Li te etabli ke aktive kalite I entèferon reseptè konplèks (IFNAR1 ak IFNAR2) deklanche yon kaskad transduction siyal medyatè pa Janus kinases TYK2 ak JAK15,6.Janus kinases fosforil transducteurs siyal yo ak activateurs protéines transcriptional (STAT1 ak STAT2) sou résidus tyrosine pou kòmanse SH2 domèn-medyatè heterodimerization6.Imedyatman, IRF9 mare STAT heterodimers yo fòme yon konplèks trimeric nan IFN-stimulated faktè 3 jèn (ISGF3), ki transloke nan nwayo a epi pwovoke transkripsyon an nan plis pase 2000 jèn entèferon-estimile (ISGs) 5,6,7,8.
ISG yo fòme kolòn vètebral sistèm iminitè natirèl la, espesyalman an repons a atak viral.Kòm yon premye liy defans kont enfeksyon viral, selil rapidman deplwaye entèraksyon vaste nan pwoteyin selilè ak yon pakèt aktivite byolojik.Pwoteyin sa yo gen ladan reseptè rekonesans modèl, molekil siyal, faktè transkripsyon, ak pwoteyin ki gen fonksyon antiviral dirèk, osi byen ke regilatè negatif repons iminitè9.Anpil nan enfòmasyon sou aktivite ISG yo soti nan ekran fonksyonèl lè l sèvi avèk ekran twòp ekspresyon10,11 oswa teknik silansman jèn (siRNA, RNAi ak CRISPR)12,13 kote ISG endividyèl yo eksprime oswa anpeche ak aktivite yo teste sou divès viris.Malgre ke etid sa yo te detèmine pwopriyete antiviral ISG endividyèl yo, mekanis molekilè ki kache nan chak ISG rete lajman enkoni.Li jeneralman aksepte ke anpil pwoteyin kominike avèk youn oswa plis sitokin pou asire aktivite konplè, kidonk swa ISG yo kominike dirèkteman oswa entèraksyon yo se medyatè pa pwoteyin selilè.Pou egzanp, yon etid resan fotocrosslinked proteomik te idantifye ATPase VCP/p97 kòm yon gwo patnè entèraksyon IFITM3, ki gen anpèchman mennen nan domaj nan klasman lizozomal, woulman, ak kotranspò nan IFITM3 ak patikil viral 14 .Lè l sèvi avèk imunopresipasyon, nou idantifye VAPA, yon pwoteyin ki asosye ak vesik, kòm yon patnè entèraksyon ak IFITM1/2/3 ki medyatè kolestewòl-medyatè spirasyon viral, e sa a te konfime pa yon lòt etid lè l sèvi avèk yon sistèm ledven de-ibrid.Sipò syantifik 15 , 16 .
Yon pwosesis byolojik fondamantal ki enplike nan repwesyon enfeksyon ak transfòmasyon malfezan se prezantasyon antijèn, ki se medyatè pa gwo molekil konplèks istokonpatibilite (MHC).Peptides (8-12 asid amine nan longè) ki soti nan pwoteyin ki fennen, prematireman sispann oswa misfolded yo chaje nan heterodimer MHC-I (ki fòme ak chenn lou ak lejè MHC-I, ki rele β-2-mikroglobulin; β2M) 17,18.Trimer MHC-I ki estab ki kapab lakòz yo transpòte nan sifas selil la, kote yo prezante peptides intraselilè nan selil T CD8+ (selil T sitotoksik)17.Selil T yo rekonèt epi detwi patojèn sa yo ak selil ki gen yon antijèn espesifik timè.Kontinwe, patojèn ak selil timè souvan siprime pwosesis prezantasyon antijèn pou evite siveyans iminitè.Anplis de sa, MHC-I se downregulated nan 40-90% nan timè imen epi li souvan asosye ak yon pronostik pi pòv19.
Jèn ki enplike nan reponn a patojèn yo dwe byen vit chanje ant yon eta de repo ak yon eta de transcription aktif.Se poutèt sa, plizyè pwoteyin selilè yo ipotèz yo dwe patisipe nan repons lan nan demann IFN segondè sou peryòd tan kout, ki gen ladan renovasyon ak modifikasyon nan kwomatin pwomotè 20,21.Pifò etid yo te konsantre sou idantifikasyon patnè pwoteyin ISG endividyèl yo nan prezans IFN.Plizyè etid pwoteomik ak transcriptomic nan sistèm selil modèl yo te elucide efè IFN sou jaden flè selilè a.Sepandan, malgre yon konpreyansyon k ap grandi sou dinamik entèferon yo pwovoke, nou toujou konnen ti kras sou patisipasyon ISG yo.Lè w ap konsidere konpleksite ak dinamik tan-depandan nan siyal entèferon, de kesyon leve: (i) èske li posib pou estabilize ak pèlen konplèks miltiprotein ki enplike nan siyal rapid, epi (ii) èske entèraksyon sa yo ka trase nan espas 3D?
Pou adrese pwoblèm sa yo, nou te aplike disuccinimide suberate-medyatè chimik cross-linking (DSS) makonnen ak espektrometri mas (CLMS) pou etidye rezo entèraksyon pwoteyin IFNα-induced ak dinamik li yo.DSS ajoute lyezon kovalan ant rezidi proximal nan pwoteyin ak / oswa konplèks pwoteyin nan vivo.Analiz MS ki vin apre yo revele sit espesifik retikilasyon ki reflete pwoksimite espasyal nan rejyon ki nan yon pwoteyin patikilye, ki rele lyen entèn, oswa sou-inite nan konplèks pwoteyin, ki rele entèrelasyon.Sèvi ak apwòch sa a, nou te idantifye plizyè nouvo konplèks pwoteyin-pwoteyin osi byen ke entèferon-induit rezo entèraksyon multiprotein.Lè nou teste plis sou yon seri nouvo entèraksyon sa yo, nou demontre ke H2BFS (H2B histone-type FS; aprè yo rele H2B) ak MDN1 aji kòm patnè obligatwa pou HLA-A.
Selil Flo-1 yo se youn nan modèl ki pi byen li te ye nan vitro nan adenokarcinom èzofaj yo paske yo imite karakteristik kle nan timè èzofaj yo22,23.Sepandan, se pa tout timè yo iminojenik, epi pou detèmine si selil Flo-1 reponn a tretman entèferon, nou trete selil Flo-1 ak 10 ng/ml IFNα pou 72 èdtan.Selil Flo-1 yo te montre endiksyon bonè nan pSTAT1 ak IRF1, kòmanse 2 èdtan apre tretman epi kontinye pou 72 èdtan, ak yon diminisyon ki depann de tan nan nivo estasyonè IRF1 (Figi 1A).ISGs (MX1, IFITM1, OAS1/2, ak ISG15) yo te jwenn fòtman pwovoke apre 6 èdtan, imite repons klasik yo nan mitan ak fen faz nan IFNα (Figi 1A).Ansanm, done sa yo sijere ke modèl selilè sa a ka itilize pou etidye repons entèferon yo.
Repons ekspresyon pwoteyin diferans nan selil Flo-1 apre tretman IFNα.(A) Ekspresyon pwoteyin nan selil Flo-1 trete ak 10 ng / ml IFNα pou 2, 6, 24, 48 ak 72 èdtan te analize pa imunoblot lè l sèvi avèk antikò ISG ki endike yo.(B) Coomassie ble tache jèl SDS-PAGE nan ekstrè selil antye apre relye ak DSS pou tan ak konsantrasyon endike yo.(C) Reprezantan immunoblot egzamine ak p53(DO-1) antikò ki soti nan menm echantiyon yo pou evalye degre nan kwa-lyezon pwoteyin.
Pou pran peyizaj entèraksyon pwoteyin in situ, nou te itilize DSS, yon ajan ki relye lajman itilize akòz pèmeyabilite segondè manbràn li yo ak tan reyaksyon relativman kout.Tan an reyaksyon ki pi kout ede anpeche fòmasyon nan gwo total de pwoteyin crosslinked, kidonk kenbe estabilite nan crosslinker la.Pou detèmine pi bon konsantrasyon DSS la epi evite over-crosslinking, nou premye ekspoze selil yo a 5, 2.5, ak 1 mM DSS pou 5, 10, 5, ak 30 minit, respektivman, epi analize lysates yo pa Coomassie-tache SDS-PAGE. (done yo pa montre).Lysates selil yo parèt yo trè relye nan konsantrasyon ki pi ba a ak nan moman ki pi kout la.Se poutèt sa, DSS te titre a 1, 0.5, ak 0.1 mM sou 5 minit (Figi 1B).Optimal crosslinking te obsève ak 0.5 mM DSS pou 5 minit, ak kondisyon sa yo te chwazi pou selil trete ak IFNα.Anplis de sa, Figi 1C montre yon Western blot fè lè l sèvi avèk p53 (DO-1) antikò pou evalye degre nan kwa-linking pwoteyin.
Selil Flo-1 yo te trete ak 10 ng / ml IFNα pou 24 èdtan anvan yo ajoute retikateur la.Selil kwa-lye yo te imedyatman lysed pa de-etap proteolysis ak pwoteyin yo te trete pa FASP (Fig. 2) 24,25.Cross-linked peptides triptik yo te analize pa espektrometri mas (figi 2).Lè sa a, spectre MS/MS yo matche ak sekans pwoteyin yo epi yo mezire ak MaxQuant26,27.Cross-linked peptides yo te idantifye nan spectre yo jwenn lè l sèvi avèk pwogram nan SIM-XL, ak konpoze endividyèl yo te konbine nan yon rezo konplèks lè l sèvi avèk tiyo yo lojisyèl enfòmatik sous louvri xQuest28 ak SIM-XL29 (figi 2).SIM-XL idantifye entèraksyon pwoteyin-pwoteyin, chenn entèn ak chenn endividyèl nan melanj pwoteyin senp oswa konplèks epi li bay scripts pou vizyalize entèraksyon nan estrikti pwoteyin.Anplis de sa, li klase chak referans kwa kòm yon nòt ID dapre kalite MS/MS29 spectre.Yo te idantifye plizyè entèraksyon ak konplèks pwoteyin-pwoteyin trè serye, epi yo te envestige yon nouvo seri entèraksyon lè l sèvi avèk ko-iminopresipasyon ak chanjman konformasyon nan konplèks lè l sèvi avèk modèl molekilè dinamik (MD) (Fig. 2) 30, 31.
Apèsi eskematik metòd CLMS la.Flo-1 selil yo te trete ak 10 ng / ml IFNα pou 24 èdtan ki te swiv pa in situ pwoteyin relye ak DSS ki te swiv pa liz selil ak trypsinization.Echantiyon ki lye kwaze yo te analize lè l sèvi avèk yon espektromèt mas Orbitrap ak plis echantiyon pou fwagmantasyon nan précurseurs peptides pandan LC-MS / MS.De peptides lye yo te idantifye nan spectre yo jwenn lè l sèvi avèk Spectrum Recognition Machine nan pwogram Crosslinked Peptides (SIM-XL), ak tout konpoze yo te konbine nan yon rezo konplèks lè l sèvi avèk tiyo enfòmatik.Filtre entèraksyon ki ba konfyans ki baze sou nòt fo pousantaj pozitif (FDR).Plizyè nouvo entèraksyon wo-fidelite pwoteyin-pwoteyin yo te konfime plis lè l sèvi avèk ko-iminopresipasyon, ak chanjman konformasyon nan konplèks yo te egzamine lè l sèvi avèk modèl molekilè dinamik (MD).
Yon total de ~ 30,500 ak ~ 28,500 peptides yo te detekte lè l sèvi avèk MaxQuant nan echantiyon IFNα ki pa ankouraje ak ankouraje, respektivman (Tablo Siplemantè S1, Fig. 3A).Distribisyon longè peptide nan tou de ka yo te montre yon pwopòsyon ki pi wo nan pi gwo peptides, ki endike prezans nan peptides kwa-lye (figi 3B, C).Anplis de sa, yon pi gwo pwopòsyon nan pi gwo peptides te prezan nan seri a 40-55 nan echantiyon IFNα-trete (figi 3C).Kat pwoteyin kont entansite log2 te montre ke pwoteyin entèferon-ankouraje klasik yo te pi abondan konpare ak echantiyon ki pa trete, ki gen ladan MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58, ak HLA-F (Figi 3D).Analiz de chemen pou pwoteyin plis pase twa fwa anrichi an repons a tretman IFNα lè l sèvi avèk baz done chemen Reactome te montre ke prezantasyon ak pwosesis antijèn MHC-I-medyatè se te chemen ki pi dominan (Figi 3E).Konfòm ak rapò anvan yo, repons antiviral medyatè pa OAS ak ISG15 osi byen ke IFNα/β ak siyal cytokine te pami chemen yo aktive.Anplis de sa, lizin- ak serin-espesifik pwoteyin kwa-lyen yo te idantifye nan orijinal akeri MS / MS spèkt yo lè l sèvi avèk SIM-XL.Yon etid resan rapòte 104 ISG ki kouvri 20 viris soti nan 9 klas viris pa meta-analiz nan etid endividyèl ISG overexpression nan 5 kalite selil9.Sepandan, simonte limit enfòmatik yo nan tès depistaj gwo done, nou te kòmanse ak yon seri done ki pi piti yo eksplore entèraksyon posib ant lis la nan jèn IRDS rapòte pa Padaria et al., pi fò nan yo se ISG yo.
Idantifikasyon diferan eksprime pwoteyin kwa-lye an repons a IFNα (done yo jwenn nan MaxQuant).(A) Dyagram Venn ki reprezante kantite peptides komen ak eksklizif yo idantifye nan echantiyon Flo-1 ki trete ak pa trete IFNα14.Distribisyon longè peptides nan echantiyon ki pa trete (B) ak trete IFNα (C) ki repwodwi.(D) Kat chalè ki reprezante log2 (entansite LFQ) ant selil Flo-1 ki pa trete ak IFNα14.Panèl gòch la montre pwoteyin ki pi aktivman aktive nan prezans IFNα.(E) Istogram ki reprezante 20 gwo chemen anrichisman apre tretman IFNα.Baz done chemen Reactome te analize plis pase kat-pliye chanjman nan pwoteyin IFNα-reponn yo.
Eksitasyon ISG entèferon-medyatè byen dokimante, men nan nivo molekilè li mal konprann ki jan pwoteyin sa yo abouti nan yon pakèt fonksyon byolojik.Nou envestige entèraksyon pwoteyin ak yon wo degre de konfyans ant ISG li te ye.Enteresan, nou idantifye yon rezo ki gen ladan MX1, USP18, ROBO1, OAS3, ak STAT1 pwoteyin ki fòme yon gwo konplèks an repons a tretman IFNα (Figi 4, Tablo S2) 32,33,34.Sa ki pi enpòtan, entèraksyon sa yo te jwenn nan tout triple trete ak IFNα epi yo pa te jwenn nan echantiyon ki pa trete, sijere ke yo te fòme espesyalman nan repons a tretman IFNα.Li konnen ke STAT1 transkripsyon kontwole ekspresyon ISG sa yo, men entèraksyon li yo ak ISG nan nivo pwoteyin pa te etidye.Estrikti kristal STAT1 te montre ke domèn helicoïdal li (CCD) pa patisipe nan entèraksyon ak ADN oswa protomers pandan fòmasyon dimers35.α-helis sa yo fòme yon estrikti helix ki bay yon zòn sifas prensipalman idrofil pou entèraksyon yo rive 35 .Nan done CLMS nou yo, nou te obsève ke pi fò nan entèraksyon yo ak STAT1 te fèt nan domèn SH2 anvan CCD a, domèn nan linker, oswa ke C-tèminal la (résid 700-708) (Figi 4A).Yon etid anvan te rapòte ke USP18 mare nan CCD ak ADN-obligatwa domèn (DBD) nan STAT2 epi li se rekrite nan subunite a nan kalite I entèferon reseptè IFNAR2 a medyatè anpèchman nan kalite I entèferon siyal 24 .Done nou yo te montre tou ke domèn katalitik USP18 la reyaji ak STAT1 DBD (Figi 4A, D), sijere ke tou de STAT1 ak STAT2 ka jwe yon wòl nan atire USP18 nan IFNAR2.
Pwoteyin-pwoteyin ISG rezo idantifye nan selil kwaze trete ak IFNα.(A) Konplo entèraksyon 2D ki montre entèraksyon pwoteyin-pwoteyin (pwodwi nan pwogram SIM-XL), ak liy ki reprezante entèraksyon entèmolekilè (koupe crosslink mete sou 3.5).Domèn idantite diferan yo make pa koulè32 yo: domèn MX1, Dynamin_N (73-249), Dynamin_M (259-547), ak GED (569-660).Domèn OAS3: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872), ak OAS1_C (903-108).Domèn ROBO1, Ig_3 (67–151), I-set (170–258), I-set (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678–758) ak fn3 (777–864).Jaden STAT1: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657), ak STAT1_TAZ2bind (715–739).(B) Viewer sikilè nan pwoteyin kwaze (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1, ak STAT1) ak entèraksyon ak entèraksyon ki make an ble ak wouj, respektivman.Papòt cross-link la te fikse nan 3.5.Pwen yo endike sit entèraksyon STAT1 ak MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E), ak OAS3 (F), osi byen ke sit entèraksyon K oswa S ant de peptides yo.Nan figi a, papòt nòt cross-link la mete sou 3.0.(G) Sit entèraksyon divès kalite ant domèn STAT1 ak OAS3 DI ki sipèpoze sou estrikti pwoteyin yo nan PyMol (sistèm grafik molekilè PyMOL, vèsyon 2.0 Schrödinger, LLC.);STAT1 (id pdb: 1bf533) ak OAS3 (id pdb: 4s3n34).) pwogram.
De izoform USP18 yo te dekri nan imen, yon pwoteyin tout longè ki se sitou sitiye nan nwayo a, ak yon izofòm san yon domèn N-tèminal, USP18-sf, ki se respire distribye nan sitoplasm la ak nwayo 36 .Anplis de sa, N-tèminal la te prevwa yo dwe unstructured epi li pa mande pou aktivite isopeptidase oswa ISG1537 obligatwa.Pifò nan entèraksyon yo idantifye nan etid nou an te lokalize nan N-tèminal nan pwoteyin nan, sijere ke entèraksyon sa yo enplike tout longè USP18 (Figi 4A, D) e konsa gen anpil chans rive nan nwayo a.Anplis, done nou yo tou endike ke N-tèminal la espesyalize pou entèraksyon pwoteyin-a-pwoteyin.Sit la obligatwa IFNAR2 sitiye ant résidus 312-368, ak miyò, pa youn nan pwoteyin ki nan konplèks la mare nan rejyon sa a (Fig. 4A) 37,38.Done sa yo pran ansanm endike ke se domèn obligatwa IFNAR2 sèlman itilize pa pwoteyin reseptè a.Anplis de sa, sèlman OAS3 ak ROBO1 yo te jwenn ki asosye ak domèn en nan N-tèminal la ak sit obligatwa IFNAR2 (Figi 4A).
ROBO1 fè pati superfanmi imunoglobulin (Ig) molekil siyal transmembran e li konsiste de senk domèn Ig ak twa domèn fibronectin (Fn) nan rejyon ekstraselilè a.Domèn ekstraselilè sa yo swiv pa yon rejyon proximal manbràn ak yon sèl helix transmembrane 39. Yon rejyon intraselilè san estrikti ki sitiye nan C-tèminal la epi li gen motif sekans konsève ki medyatè lyezon pwoteyin efèktè39.Rejyon ki pwolonje soti nan asid amine ~ 1100 a 1600 se sitou dezòdone.Nou te jwenn ke MX1 reyaji ak ROBO1 atravè Ig, Fn, ak domèn entraselilè, pandan y ap pifò entèraksyon ak STAT1 rive ant CCD li yo, domèn linker, ak C-tèminal ROBO1 (Fig. 4A, E).Nan lòt men an, entèraksyon ak rejyon lyetè DI, DIII, ak OAS3 yo te distribye nan tout pwoteyin ROBO1 (Fig. 4A).
Pwoteyin fanmi oligoadenylate synthase (OAS) aksepte ak mare RNA doub-cheche intraselilè (dsRNA), sibi chanjman konformasyon, epi sentèz 2′,5′-lye oligoadenylates (2-5 As) 40 .Yo te jwenn ke pami twa OAS yo, OAS3 montre pi gwo afinite pou dsRNA ak sentèz pi piti kantite 2-5 As, ki ka aktive RNase L epi kidonk limite replikasyon viral 41 .Fanmi OAS la konsiste de domèn nukleotid transferaz ki tankou polymerase beta (pol-β).Rechèch anvan yo te montre ke aktivite katalitik nan domèn C-tèminal (DIII) depann sou domèn nan dsRNA-obligatwa (DI), ki nesesè pou aktivasyon nan OAS342.Nou te obsève ke domèn DI ak DII nan OAS3 kominike avèk CCD ak yon ti rejyon junction ant SH2 ak STAT1 TAD (Figi 4A, F).Koupe diferan sit crosslinking sou estrikti pwoteyin lan revele yon entèraksyon ant β-fèy la ak DBD STAT1 bouk ak yon pòch louvri oswa kavite ki te fòme pa résidus 60-75 nan domèn nan DI nan OAS3 (Fig. 4G).Oryantasyon an nan pwoteyin yo nan konplèks la tou endike ke okenn nan entèraksyon yo ak OAS3 entèfere ak kapasite nan DNA-obligatwa nan domèn DI li yo (Fig. S1A).Anplis de sa, domèn N-tèminal GTPase MX1 reyaji anpil ak domèn DI ak DIII nan OAS3 (figi 4A).Nou te obsève tou yon entèraksyon ant OAS1 ak MX1 nan tout twa IFNα-trete repete, kote yon sèl domèn OAS1 (tou katalitikman aktif) kominike ak tout twa domèn MX1 (Figi S2A, B).
Pwoteyin MX yo fè pati yon gwo fanmi GTPase dynein ki gen yon domèn GTPase N-tèminal ki mare ak idrolize GTP, yon domèn entèmedyè ki medyatè pwòp tèt ou-asanble, ak yon zip leucine C-terminal ki aji kòm yon GTPase (LZ). ).domèn efèktè domèn25,43.MX1 mare nan subinite polymeraz viral yo pou bloke transkripsyon jèn viral la43.Yon ekran de-ibrid ledven te rapòte deja te montre ke MX1 ki asosye ak PIAS1 inibit aktivasyon jèn STAT1-medyatè pa bloke aktivite ADN-obligatwa epi tou li gen SUMO E344,45 aktivite ligase.Isit la, nou demontre ke MX1 mare ak STAT1 (Figi 4C, D), sepandan ki jan entèraksyon sa a afekte aktivasyon jèn STAT1-medyatè an repons a IFNα bezwen plis etid.Anplis de sa, nou menm tou nou te jwenn ke MX1 kominike avèk IFIT3 ak DDX60 nan tout twa repete IFNα-trete (figi S2C).
DDX60 se yon helicase cytoplasmic IFN-induit ki te deja rapòte yo jwe yon wòl nan degradasyon RIG-I-endepandan nan RNA46 viral.Li reyaji ak RIG-I epi aktive siyal li nan yon fason espesifik ligand 46. DDX60 konsiste de yon domèn helicase DEXD/H-Box ak yon domèn helicase C-terminal ki mare RNA viral ak DNA47.Pifò nan entèraksyon li yo ak MX1 ak IFIT3 rive nan rejyon long N- ak C-tèminal san domèn kanonik oswa motif (Fig. S2E, F).Sepandan, MX1 asosye tou ak domèn helicase DEXD/H-Box (figi S2E).Pwoteyin nan fanmi IFIT gen kopi tandem nan yon motif diferan helix-vire-helix ki rele repetisyon tetrapeptide (TPR).IFIT3 te jwenn yon modulateur pozitif nan siyal RIG-I e pakonsekan yon eleman nan konplèks MAVS la.Ansanm, done nou yo sijere ke IFIT3 ak DDX60 kominike sitou nan rejyon ki genyen ant TPR 3-6 nan IFIT3 epi yo ka jwe yon wòl nan siyal RIG-I / MAVS (Fig. S2F).
Etandone ke tès depistaj tout pwoteòm nan se entansif enfòmatik, Lè sa a, nou teste tout baz done UniProt imen an pou prezans nan youn nan repete IFNα-trete yo.Nan kopi sa a, nou te jwenn plizyè rezo entèraksyon trè serye pou HLA-A.Analiz de chemen pwoteyin idantifye pa MS / MS spectre te montre ke pwosesis antijèn ki baze sou MHC-I ak prezantasyon se chemen prensipal ki pwovoke pa entèferon (figi 3D).Se poutèt sa, nou konsantre sou etidye entèraksyon pwoteyin nan molekil MHC-I ak yon wo degre de konfyans nan tout echantiyon kwa-lye.HLA konsiste de domèn α1, α2 ak α3 ak chenn limyè, ak mikroglobulin β2 (β2m) se yon pwoteyin chaperone konstan49.Yon fwa reyini nan retikul andoplasmik la, HLA enstab nan absans ligand peptide50.Groove peptide-obligatwa a fòme pa domèn α1 ak α2 trè polimòfik ak san estrikti nan fòm ki pa peptide ak domèn nan α351 relativman mwens polimòfik.Nan prezans IFNα, nou detekte de konplèks HLA-A: youn reyaji ak HMGA1 ak H2B (Figi 5, Tablo S3) ak lòt la reyaji ak MDN1, LRCH4 ak H2B (Figi 6).
IFNα pwovoke yon rezo entèraksyon HLA-A ak H2B (H2BFS) ak HMGA1.(A) Trase 2D (pwodwi nan lojisyèl SIM-XL) ki dekri diferan kalite entèraksyon nan konplèks H2B-HLA-A-HMGA1: interlink (ble), interlink (wouj) ak sèl lyen (nwa)..Domèn idantite diferan yo kode koulè32: H2B (histone; 2–102) ak MHC-I (MHC_1; 25–203, gwoup C1; 210–290 ak MHC_I_C; 337–364).Papòt cross-link la te fikse nan 3.5.Pwen yo endike sit entèraksyon HLA-A ak H2B (B) ak HMGA1 (C), osi byen ke sit entèraksyon K oswa S ant de peptides yo.Nan figi a, papòt nòt cross-link la mete sou 3.0.(D) Relasyon ant pwoteyin yo montre nan estrikti pwoteyin H2B, HLA-A, ak HMGA1 nan pwogram PyMOL la.Estrikti sa yo te modle lè l sèvi avèk sèvè Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) ak estrikti modèl pou pwoteyin H2B, HLA-A ak HMGA1 yo te 1kx552, 1kj349 ak 2eze55, respektivman.
IFNα pwovoke yon rezo entèraksyon HLA-A ak H2B (H2BFS), MDN1 ak LRCH4.(A) Entramolekilè (wouj) ak entèmolekilè (ble) lyen ki prezante sou yon kat jeyografik entèaktif 2D (pwodwi nan lojisyèl SIM-XL) ak MDN1 reprezante kòm yon sèk.Papòt cross-link la te fikse nan 3.5.Domèn idantite diferan yo kode koulè32: H2B (histone; 2–102), MHC-I (MHC_1; 25–203, gwoup C1; 210–290 ak MHC_I_C; 337–364) ak LRCH4 (LRR_8 (68–126), LRR_8 (137–194) ak CH (535–641)).(B) Relasyon ant pwoteyin yo montre nan estrikti pwoteyin H2B, HLA-A, LRCH4, ak MDN1 nan pwogram PyMOL la.Yo te modle estrikti sa yo lè l sèvi avèk sèvè Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) ak estrikti modèl 1kx552, 1kj349, 6hlu62 ak 6i2665 pou pwoteyin H2B, HLA-A, LRCH4 ak MDN1, respektivman.Pwen ki montre sit entèraksyon K oswa S pou HLA-A ak H2B (C), LRCH4 (D), ak MDN1 (E).Pou simityè yo, papòt nòt kwa-link yo te fikse a 3.0.
Anplis de sa nan kenbe entegrite nan genòm nan, histon H2B tou patisipe nan règleman an nan transcription.Pwoteyin H2B a konsiste de yon domèn histon santral (HFD) ki fòme pa twa α-helis ki separe pa bouk ak yon ke C-tèminal 41,52.Pifò nan entèraksyon an ak H2B rive nan α1 helix la, ki bay trimerization ak heterodimer HFD (Fig. 5A, B).Malgre ke lizin yo patisipe nan lyezon ADN, gen kèk lizin yo tou sit altènatif asetilasyon oswa metilasyon.Pou egzanp, résidus K43, K46, ak K57 ki soti nan H2B yo pa patisipe nan lyezon ADN dirèk, men yo se sib nan divès kalite modifikasyon apre transcription53.Menm jan an tou, résidus K44, K47, ak K57 nan H2B ka jwe yon wòl altènatif nan prezans IFNα, ki gen ladan entèraksyon ak lòt pwoteyin (Fig. 5A, B).Anplis de sa, histon extrachromosomal H2B aktive repons iminitè a nan divès kalite selil, aji kòm yon Capteur sitosol pou detekte fragman ADN doub-bloke (dsDNA) ki sòti nan ajan enfektye oswa selil domaje54.Nan prezans viris ADN, rediksyon H2B anpeche pwodiksyon IFN-β ak fosforilasyon STAT154.H2B se tou li te ye pou avanse pou pi antre ak soti nan nwayo a pi vit pase lòt histones nwayo54.Yo te obsève entèraksyon H2B ak MDN1 ak LRCH4 tou nan echantiyon ki pa trete yo.Nou te jwenn ke HLA-A te reyaji ak H2B nan tout twa echantiyon IFNα-trete ak nan yon sèl echantiyon repete ki pa trete.Done sa yo reflete wòl H2B nan yon fonksyon altènatif fizyolojik endepandan de règleman transcription.
HMGA1 (gwoup mobilite segondè AT-Hook 1), yon ti nukleoprotein ki rich nan asid amine ki ankouraje maladi, yo te idantifye an asosyasyon ak HLA-A.Li gen yon ke asid C-tèminal ak twa DBD diferan ki rele AT kwòk paske yo mare nan ti Groove nan rejyon ki rich nan AT nan dsDNA55,56.Obligatwa sa a lakòz ADN nan pliye oswa dwat, sa ki pèmèt faktè transkripsyon kanonik jwenn aksè nan sekans konsansis li yo.Yo kwè ke C-tèminal la patisipe nan entèraksyon pwoteyin-pwoteyin ak rekritman faktè transcription, depi mutan sipresyon C-tèminal yo pa kapab kòmanse transcription57.Anplis, domèn sa a gen plizyè sit fosforilasyon konsève ke yo rekonèt substrats pou kinaz 58 .Nou te obsève entèraksyon HLA-A ak H2B ak HMGA1 deyò domèn C-tèminal la, ki sijere ke domèn C-tèminal la sitou itilize pou obligatwa faktè transcription (Fig. 5A, C).Pwoteyin HMGA fè konpetisyon ak histon H1 pou lye ak ADN adaptè, kidonk ogmante aksè57.Menm jan an tou, li sanble ke HMGA reyaji ak histon H2B ansanm ADN nan linker nan konpetisyon ak histon H1.HMGB1 pwovoke ekspresyon HLA-A, -B, ak -C nan selil dendritik, ki mennen nan aktivasyon yo59, men yo pa te rapòte yon entèraksyon ant HMG ak HLA.Nou te jwenn ke HMGA1 reyaji ak domèn α1 ak α3 nan HLA-A, ak pi fò nan entèraksyon yo deyò nan 3 DBD li yo (Figi 5A, C).Nan men nou, yo te jwenn HLA-A yo lokalize nan nwayo a (done yo pa montre), epi bay H2B ak HMGA1 yo prezan tou nan nwayo a, entèraksyon sa a gen anpil chans rive nan nwayo a.Adduct espesifik ki mezire ant H2B, HLA-A, ak HMGA1 yo montre nan Figi 5D.
Pifò entèraksyon HLA-A ak lòt pwoteyin rive nan domèn α1 ak α2 li yo ak domèn C-tèminal dezòd (figi 6).Nan youn nan egzanp sa yo, nou te jwenn ke HLA-A reyaji avèk ke N-tèminal dezòd nan LRCH4 (Figi 6A, D).LRCH4 kontwole aktivasyon TLR4 ak endiksyon sitokin LPS, kidonk modil repons iminitè natirèl la60,61.Li se yon pwoteyin manbràn ki gen nèf repetisyon leucine-rich (LRRs) ak yon motif omoloji kalmodulin (CH) nan ectodomain li, ki te swiv pa yon domèn transmembrane (TMD) 60 , 62 .Domèn CH yo te rapòte kòm medyatè entèraksyon pwoteyin-pwoteyin 60 .Yon detire apeprè 300 asid amine ant domèn LRR ak CH relativman aksesib men dezòdone.Ki baze sou fonksyon rejyon dezòd kòm medyatè rezo pwoteyin-pwoteyin ak transpò vesiculaire 63, nou te jwenn ke pifò entèraksyon pwoteyin rive nan rejyon dezòdone.Entèraksyon ak MDN1 yo te distribye nan tout longè pwoteyin nan, ki gen ladan domèn LRR1, LRR6, CH, ak rejyon o aza, pandan y ap H2B sitou mare nan domèn CH (Fig. 6A, B).Miyò, pa youn nan entèraksyon yo enkli TMJ a, ki sijere espesifik nan apwòch la CLMS (Figi 6A, B).
MDN1 te idantifye tou kòm yon pati nan rezo pwoteyin HLA-A (Figi 6A).Li fè pati fanmi AAA nan pwoteyin (ATPases ki asosye ak aktivite diferan).Sa a se menm domèn N-tèminal AAA ki òganize nan yon bag hexameric epi retire faktè asanble a nan subunite ribosomal 60S 64 la.parèt sanble ak dynein64,65,66.Anplis de sa, rejyon rich Asp/Glu ki te swiv pa domèn MIDAS (sit depandan ion metal).Akòz gwo gwosè MDN1 (apeprè 5600 asid amine) ak homoloji limite li yo ak pwoteyin byen etidye, yo konnen ti kras sou estrikti li yo ak fonksyon nan imen.Nou idantifye HLA-A, H2B, ak LRCH4 kòm patnè obligatwa MDN1 ak revele oryantasyon yo kòm konplèks pwoteyin nan PyMol (Fig. 6A, B).Twa pwoteyin sa yo kominike avèk domèn AAA, domèn linker tankou dynein, epi pètèt domèn MIDAS MDN1.Nan yon rapò anvan, pirifikasyon afinite nan pwoteyin Garnier idantifye MDN1 kòm yon pwoteyin ki asosye ak histon H2B67.Anplis de sa, yon etid resan rapòte tou yon entèraksyon ant MDN ak HLA-B nan selil HCT116 lè l sèvi avèk spèktrometri mas afinite-pirifye, sipòte rezilta nou yo68.Idantifikasyon konplèks sa a nan echantiyon trete IFNα sijere yon wòl pou MDN1 nan siyal entèferon.
Paske jèn HLA yo trè polimòfik, nou ekstrè sekans li kat HLA-A, -B, ak -C soti nan done sekans RNA nan selil Flo-1 (done yo pa montre).Sekans peptides ki konsistan avèk lekti sekans yo te revele diferans enpòtan ant HLA-A, -B, ak -C nan rejyon kote peptides kwaze yo te lokalize nan HLA-A (Figi S3).Anplis de sa, nou pa t 'obsève pwoteyin-a-pwoteyin kwa-linking nan molekil HLA-B / C ak pwoteyin H2B / HMGA1 / MDN1 / LRCH4.Sa a sijere ke entèraksyon an pwoteyin yo te jwenn ant HLA-A, MDN1, LRCH1 ak HMGA1 se HLA-A espesifik.Anplis de sa, analiz pwoteomik echantiyon ki pa retike (Tablo S4) te montre ke HLA-A gen pi wo pwoteksyon sekans konpare ak HLA-B oswa HLA-C.Peptid yo idantifye pou HLA-A yo te wo nan entansite nan tou de echantiyon IFNα-trete ak echantiyon ki pa trete.
Pou asire ke entèraksyon yo idantifye isit la pa t akòz kwaze ki pa espesifik nan de pwoteyin nan pwoksimite espasyal, nou konfime plis de nouvo faktè kominike HLA-A lè nou fè tès ko-iminopresipasyon.Entèraksyon HLA-A ak MDN1 andojèn ak H2B yo te detekte nan tou de selil Flo-1 ki trete ak IFNα (Figi 7, Figi S4).Nou konfime ke HLA-A te kaptire pa H2B nan imunoprecipitates yo e ke asosyasyon sa a te akòz tretman IFNα depi HLA-A te absan nan echantiyon imunoprecipitates yo nan selil ki pa trete (Figi 7A).Sepandan, done nou yo sijere ke IFNα diferan kontwole HLA-A obligatwa nan H2B ak MDN1.IFNα pwovoke asosyasyon ant H2B ak HLA-A, men diminye asosyasyon li yo ak MDN1.Nou te jwenn ke MDN1 te asosye ak HLA-A nan kontwòl, ak adisyon a nan IFNα redwi entèraksyon sa a endepandan de endiksyon MDN1 pa IFNα (Figi 7B, C).Anplis de sa, HLA-A iminopresipitasyon te kaptire H2B nan selil A549 (Fig. S4), sijere ke entèraksyon sa a se endepandan de kalite selil.Ansanm, rezilta sa yo sipòte entèraksyon entèferon-medyatè HLA-A ak H2B ak MDN1.
HLA-A ko-pirifye H2B ak MDN1.Reprezantatif andojèn H2B (A) ak MDN1 (B) imunoblots yo te iminoprecipite soti nan selil Flo-1 trete IFNα ak sonde pou antikò ki endike yo.Sourit ak lapen IgG yo te itilize kòm yon kontwòl negatif.(C) kantite relatif (antre) nan antijèn diferan yo montre pa imunoblots sonde kont antikò endike, β-aktin te itilize kòm yon kontwòl loading.
Pwopriyete estriktirèl youn nan entèferon-induit trè serye rezo kwaze, H2B-HLA-A-HMGA1, yo te envestige.Nou itilize modèl molekilè dinamik kòm yon apwòch altènatif pou konprann dinamik konformasyon pwoteyin ki enplike nan konplèks sa a (Figi 8).Enferans ki soti nan done CLMS yo sijere posiblite pou diferan konfòmasyon nan pwoteyin H2B, HLA-A ak HMGA1.Se poutèt sa, konplèks potansyèl sa yo te modle nan yon mwayen sòlvan: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A, ak H2B-HLA-A-HMGA1.Yon premye ekran anbakadè pwoteyin-pwoteyin lè l sèvi avèk pake MOE (Molecular Operating Environment; Chemical Computing Group Inc., Monreyal, Quebec, Kanada) te sijere konformasyon posib ki diferan ant pwoteyin sa yo (Fig. 8A).Vizyalizasyon konplèks pwoteyin debakadè a revele plizyè entèraksyon ak konformasyon posib (Figi 5A, 8).Kidonk, yo montre yon sèl konformasyon posib nan Figi 8A (avèk lyen kwaze ki make) epi li te evalye plis lè l sèvi avèk tiyo modèl MD la.Anplis de sa, obligatwa H2B oswa HMGA1 ak HLA-A mete aksan sou afinite ki pi wo nan H2B pou HLA-A (figi 8A).
Dinamik konformasyon rezo posib ant H2B (H2BFS)-HLA-A, HMGA1-HLA-A, ak H2B-HLA-A-HMGA1 konplèks.(A) Panèl bò gòch se yon kat jeyografik 2D (pwodwi nan lojisyèl SIM-XL) nan lyen kwaze intramolekilè (wouj) ak entèrmolekilè (ble) (koupe crosslink mete sou 3.5).Anplis de sa, rezidi kwaze yo idantifye yo make sou estrikti pwoteyin H2B, HLA-A ak HMGA1.Konfòmasyon ki asosye nan pwoteyin sa yo te ekstrè lè l sèvi avèk tiyo anbakadè aplike nan pake MOE a.Panèl ki pi ba gòch la montre divès kalite konformasyon posib nan konplèks H2B-HLA-A ak HMGA1-HLA-A ak diferan afinite pwoteyin-pwoteyin (GBVI/WSA dG; kcal/mol).(B) Devyasyon estanda (RMSD) nan pozisyon atomik (eksepte atòm idwojèn) pou chak estrikti pwoteyin.(C) Intermolecular pwoteyin-pwoteyin idwojèn kosyon entèraksyon ki soti nan divès konplèks simulation konsidere entèraksyon espesifik ki dire ≥ 10 ns.Distans koupe h-bond donatè-akseptè a te fikse a 3.5 Å, epi ang koupe donatè-H-akseptè a te fikse a ≥ 160 °-180 °.(D) Résidus ki make ki fòme entèraksyon pwoteyin-pwoteyin HLA-A ak patnè respektif yo, spanning ≥ 20 ns, ekstrè nan konplèks HLA-A-H2B ak HLA-A-HMGA1 enbesil.Estrikti pwoteyin reprezante yon estrikti mwayèn nan 100 ns MDS.(E) Entèraksyon ant HLA-A-H2B ak HLA-A-HMGA1 konplèks konpare ak entèraksyon Suivi pa H2B-HLA simulation sou 100 ns ki baze sou sit entèraksyon K oswa S ant de peptides yo.Konplèks /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.Valè papòt la pou evalyasyon kwa-lyen yo te fikse a 3.0, epi entèraksyon espesifik nan MDS pran ≥ 10 ns yo te pran an kont.Estrikti pwoteyin yo te vizyalize lè l sèvi avèk BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, USA) ak Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Monreyal, Quebec, Kanada).
Estabilite nan molekil HLA-A sou tan (devyasyon estanda; RMSD oswa devyasyon estanda; RMSF) endike ke prezans nan H2B oswa HMGA1 pwoteyin nan konplèks yo estabilize HLA-A (Figi 8B, Figi S5).Pwoteyin HMGA1 mare byen sere nan sit B2M HLA-A, pwovoke estabilite asid amine HLA-A nan konplèks HLA-A-HMGA1 oswa H2B-HLA-A-HMGA1 (Figi 8B, Figi S5).an patikilye, rezidi HLA ~ 60-90 ak ~ 180-210 yo te jwenn yo dwe mwens fleksib nan prezans H2B (FIG. 8B).H2B ak HMGA1 te montre pi bon obligatwa nan HLA-A nan konplèks H2B-HLA-A-HMGA1 konpare ak HLA-A obligatwa nan H2B oswa HMGA1 pou kont li (Figi 8C, D; Tablo S5).Résidus ki enplike nan lyezon idwojèn (MD modle gwo lokatè ≥ 10 ns) kowenside ak sit entèraksyon CLMS (K oswa S rezidi) nan konplèks la, sijere ke entèraksyon yo idantifye pa CLMS yo trè serye.Fyab (figi 8E).Nan CLMS ak MD modèl, HLA-A résidus ant apeprè 190-210 ak apeprè 200-220 asid amine yo te jwenn mare H2B ak HMGA1, respektivman (FIG. 8E).
Entèraksyon pwoteyin-pwoteyin fòme rezo estriktirèl dinamik ki medyatè kominikasyon entraselilè an repons a sèten stimuli.Paske anpil apwòch pwoteomik detekte chanjman nan nivo eta an jeneral nan yon pwoteyin, dinamik entèraksyon pwoteyin-pwoteyin mande pou zouti adisyonèl pou kaptire koòdone obligatwa, ak CLMS se youn zouti sa yo.Sistèm siyal entèferon an se yon rezo cytokine ki pèmèt selil yo reponn a yon seri siyal patojèn nan anviwònman an ak siyal patolojik intrinsèques, ki abouti nan endiksyon nan sous-ansanm nan pwoteyin entèferon-induzibl.Nou te aplike CLMS pou detèmine si yo ta ka idantifye nouvo entèraksyon pwoteyin-pwoteyin nan mitan yon panèl pwoteyin entèferon-induit.Yo te itilize analiz mondyal relye pwoteyin nan yon modèl selil Flo-1 ki reponn ak entèferon pou kaptire konplèks pwoteyin.Ekstraksyon peptides tryptic soti nan selil ki pa kwaze ak kwaze pèmèt pou konte peptide, anrichisman chemen, ak distribisyon longè peptide ak entansite LFQ defini.Pwoteyin kanonik entèferon-induzibl yo te idantifye kòm yon kontwòl entèn pozitif, pandan y ap obsève nouvo adducts intermolecular ak intramolecular nan pwoteyin entèferon-inducible kanonik tankou MX1, UP18, OAS3 ak STAT1.Yo te envestige plizyè karakteristik estriktirèl ak entèraksyon nan zòn fonksyonèl yo.
Yon entèraksyon ant HLA-A, MDN1 ak H2B te detekte pa imunoblotting nan Flo-1 ak selil A549 trete ak trete ak IFNα.Rezilta nou yo mete aksan sou ke HLA-A konplèks ak H2B nan yon fason ki depann de IFNα.Travay nou an reprezante yon avni enteresan pou plis eksplorasyon nan ko-lokalizasyon de konplèks sa yo.Li ta enteresan tou pou elaji apwòch CLMS la nan yon panèl liy selil yo pou idantifye entèraksyon pwoteyin entèferon-medyate ki pa entèferon-kalite selil yo.Finalman, nou te itilize modèl MD kòm yon apwòch altènatif pou konprann dinamik konformasyon pwoteyin ki enplike nan konplèks H2BFS-HLA-A-HMGA1, ki te swiv diskisyon intramolekilè ak entèmolekilè.Enferans ki soti nan done CLMS yo sijere posiblite pou diferan konfòmasyon nan pwoteyin H2BFS, HLA-A, ak HMGA1.Konfòmasyon diferan posib ant konplèks pwoteyin docking sa yo revele plizyè entèraksyon ki sanble ak sa yo obsève nan seri done CLMS la.Youn nan fòs prensipal yo nan metòd nou an se ke li pèmèt idantifikasyon fasil nan kominike jèn trè polimòfik tankou HLA, kidonk li pral enteresan yo etidye entèraksyon nan HLA haplotype-espesifik pwoteyin ki otreman difisil yo etidye.Ansanm, done nou yo demontre ke CLMS ka itilize pou elaji konpreyansyon nou sou rezo siyal entèferon-induit epi bay yon baz pou etidye sistèm entèselilè ki pi konplèks nan mikroanvironman timè a.
Flo-1 selil yo te jwenn nan ATCC epi konsève nan DMEM (Gibco) complétée ak 1% penisilin / streptomycin (Invitrogen), 10% serom fetis bovin (Gibco) epi estoke nan 37 ° C ak 5% CO2.Enkubasyon.Selil yo te grandi nan 70-80% konfluyans anvan yo te trete ak IFNα14 (fabrike pa Edinburgh Pwoteyin Pwodiksyon Etablisman).Tout lòt pwodui chimik ak reyaktif yo te achte nan men Sigma Aldrich sof si yo te note otreman.
Flo-1 selil yo te kiltive nan plak 6-byen ak jou kap vini an selil yo te trete ak 10 ng / ml IFNα14 pou 24 èdtan nan apeprè 80% konfluans.Selil yo te lave twa fwa ak PBS ak ligated ak frèch prepare DSS (Thermo Fisher Scientific) (fonn nan DMSO) nan PBS pou 5 min nan 37 ° C. nan yon konsantrasyon final nan 0.5 mM.Reyaksyon crosslinking DSS la te ranplase ak PBS ak DSS rezidyèl te etenn lè yo ajoute 20 mM Tris (pH 8.0) nan PBS pou 15 min nan 37 ° C.Selil yo te kolekte pa grate ak kolekte nan tib obligatwa ki ba (Aksijèn).
Te grenn selil la lysed ak 300 µl tanpon liz ure (8 M ure, 0.1 M Tris, pH 8.5) pou 30 min nan tanperati chanm ak souke okazyonèl.Tout etap santrifujasyon yo te fèt nan 14,000 xg nan 8 ° C.Santrifize lysate la pou 10 minit epi transfere supernatant la nan yon nouvo tib.Rete patikil klè yo te fonn nan 150 μl nan dezyèm tanpon lysis la (2 M ure, 2% (w/v) SDS (sodyòm dodecyl sulfat)) pou 30 minit oswa plis jiskaske yo jwenn yon solisyon akeuz omojèn.Lisat la te santrifuje pou 20 minit epi supernatant la te melanje ak lisat la te jwenn nan etap anvan an.Konsantrasyon pwoteyin yo te evalye lè l sèvi avèk tès Micro BCA (Thermo Fisher Scientific) dapre enstriksyon manifakti a pou pwosedi mikroplak yo.Echantiyon yo te byen vit jele nan nitwojèn likid epi estoke nan -80 ° C.
Apeprè 100 μg nan pwoteyin idrosolubl kwa-lye te trete lè l sèvi avèk yon pwotokòl preparasyon echantiyon filtraj modifye (FASP) jan sa dekri pa Wisniewski et al.69 Yon ti tan, pwoteyin nan retike ak 200 µl tanpon ure (8 M ure nan 0.1 M Tris, pH 8.5), vortex ak mwatye.Tout etap santrifujasyon yo te fèt nan 14,000 xg nan 25 ° C.Premye mwatye nan lisat pwoteyin relye a te transfere nan yon aparèy filtre santrifujeur 10 kDa Microcon ekipe ak yon manbràn Ultracel-10 (Merck), ki te swiv pa santrifujasyon sou filtè a pou 25 minit.Lè sa a, ajoute dezyèm mwatye nan pwoteyin nan filtè a epi repete menm etap yo.Rekiperasyon pwoteyin yo te fèt lè yo ajoute 100 μl nan 17 mM tris (2-carboxyethyl) fosfin idroklorid (TCEP) nan tanpon ure.Recovery te brase sou yon thermomixer nan 600 rpm pou 30 min nan 37 ° C.Anplis de sa, yo te santrifuje kolòn nan epi redwi pwoteyin kwa-lye a te alkylated lè l sèvi avèk 100 μl nan 50 mM iodoacetamide nan tanpon ure.Reyaksyon alkilasyon an te pote soti nan tanperati chanm pou 20 minit nan fè nwa a.Wotasyon kolòn nan, lave mi kolòn yo 3 fwa ak 100 µl tanpon ure, epi answit santrifuje.Menm operasyon an te fèt 3 fwa lè l sèvi avèk 100 μl nan 100 mM bikabonat amonyòm.Anvan trypsinization, ranplase tib koleksyon an ak yon nouvo.Ajoute tanpon dijesyon ki gen 50 mM bikabonat amonyòm ak 1 µl tripsin dilye nan tanpon tripsin (Promega).Yo te kenbe rapò tripsin ak pwoteyin nan apeprè 1:33, ak reyaksyon dijesyon yo te enkube lannwit lan nan 37 ° C nan yon chanm imid.Te peptide crosslinked la eliye nan filtè a pa santrifujasyon pou 25 minit.Rekiperasyon peptide te amelyore lè yo ajoute 50 μl nan 0.5 M NaCl nan filtè a, ki te swiv pa santrifujasyon pou 25 minit.
C18 Micro Spin kolòn (Harvard Apparatus) yo te itilize pou desal peptides tryptic ki lye ak pwotokòl ki dekri pa Bouchal et al.70 ak modifikasyon minè.Yon ti tan, kolòn vire C18 yo te aktive ak twa lave nan 0.1% asid fòmik (FA) nan acetonitrile (AcN) (Merck) ak de lave nan 0.1% FA.Kolòn nan te idrate ak 0.1% FA pou 15 minit.Chaje echantiyon yo nan kolòn vire epi lave 3 fwa ak 0.1% FA.Peptides desaled yo te sekans eliye ak yon gradyan pa etap lè l sèvi avèk 50%, 80% ak 100% AcN nan 0.1% FA.Echantiyon yo te cheche nan yon konsantratè SpeedVac Plus (Eppendorf) jiskaske likid rezidyèl la disparèt nèt.Peptid yo eliye yo te fonn nan 100 μl nan 0.08% asid trifluoroacetic nan 2.5% AcN ak konsantrasyon yo te mezire sou yon NanoDrop 2000 (Thermo Syantifik).Apeprè 1 μg peptide crosslinked pou chak echantiyon yo te sou fòm piki nan sistèm LC-MS/MS.
Peptid ki lye kwaze yo te separe sou yon sistèm UltiMate 3000 RSLCnano LC (Thermo Scientific) ki konekte ak yon espektromèt mas Orbitrap Exploris 480 (Thermo Scientific).Peptid ki lye kwaze yo te kolekte sou yon ID 300 µm, 5 mm longè µ-pre-kolòn C18 kolòn kaptire chaje ak C18 PepMap100 sorbent ak 5 µm PepMap sorbent (Thermo Syantifik).Chaje koule ponp lan mete nan 5 µl/min 0.08% asid trifluoroacetic ki fonn nan 2.5% AcN.Peptid kwa-lye yo te separe sou yon kolòn analyse silica fusion ak yon dyamèt enteryè 75 μm ak yon longè 150 mm, plen ak yon sorbent PepMap 2 μm (Thermo Scientific).Faz mobil A ak B fèt nan 0.1% FA nan dlo ak 0.1% FA nan asetonitrile, respektivman.Gradyan an kòmanse nan 2.5% B epi li ogmante lineyèman a 40% B sou 90 minit, Lè sa a, nan 90% B sou 2 minit kap vini yo.Konpozisyon faz mobil lan te kenbe nan 90% B pou 10 minit ak Lè sa a, diminye lineyè a 2.5% B sou 2 minit.Kolòn nan te ekilibre nan 2.5% B pou 8 minit anvan pwochen sik la.Peptid kwa-lye ki soti nan kolòn analyse a yo te ionize nan yon sous nanoelectrospray ionizasyon (NSI) epi yo te sou fòm piki nan yon espektwomèt mas Exploris 480 (Thermo Scientific).
Espektromèt mas Orbitrap Exploris 480 te opere nan mòd korelasyon done pozitif.Yo te fè yon eskanè konplè nan mòd seksyon nan yon rezolisyon 120,000 ak anviwònman ranje soti nan m/z 350 Th pou m/z 2000 Th.Yo te fikse objektif AGC nòmalize a 300% ak yon tan maksimòm 50ms.Yo te etabli deteksyon pik monoizotopik pou peptides.Paramèt detant kontrent la mete sou vre si yo jwenn twò kèk précurseur.Yo te mete fòs iyonik minimòm de précurseur a 5.0e3 ak eta chaj précurseur jiska +8 te enkli nan eksperyans yo.
Tan sik la ant gwo analiz nan mòd korelasyon done yo te fikse a 2.5 segonn.Esklizyon mas dinamik te mete sou 20 s apre premye fwagmantasyon ion précurseur a.Fenèt izolasyon précurseur la te mete sou 2 Th.Kalite enèji kolizyon nòmal ak yon mòd enèji kolizyon fiks te chwazi nan yon eskanè MS/MS ki depann de done.Enèji kolizyon mete a 30%.Rezolisyon Orbitrap la te fikse a 15,000 ak sib AGC a 100%.Tan an piki maksimòm koutim mete nan 60 milisgond.
Anvan yo swiv rezo pwoteyin-pwoteyin nan echantiyon kwaze, nou trete fichye anvan tout koreksyon yo lè l sèvi avèk pake MaxQuant (vèsyon 1.6.12.0)26,27 pou idantifye peptides/pwoteyin retrace nan echantiyon yo.Anplis de sa, yo te fè analiz pwoteomik menm jan an sou echantiyon Flo-1 ki pa repwoche ak trete ak trete ak IFNα.Done MS/MS yo te fouye nan baz done moun UniProt (www.uniprot.org) (telechaje 12 out 2020, gen 75,093 antre) lè l sèvi avèk motè rechèch entegre Andromeda27 la.Rechèch la te fèt san yo pa endike espesifik nan anzim la ak divès kalite modifikasyon nan deamidasyon (N, Q) ak oksidasyon (M).Tolerans mas précurseur yo te mete nan 20 ppm ak iyon pwodwi nan 0.02 Da.Devyasyon inisyal ak maksimòm mas la te mete sou 10 ppm.Mas maksimòm peptide a te fikse nan 4600 Da ak resanblans sekans yo te fikse ant 7 ak 25 asid amine (aa).Pli lwen analiz estatistik yo te fèt lè l sèvi avèk pwogram nan Perseus (vèsyon 1.6.10.45).Kontni pwoteyin yo te kalkile pa nòmalize entansite espèk pwoteyin nan (entansite LFQ; kantite ki pa make)27 ak valè entansite yo te konvèti nan Log2.Yon gwoup yerarchize nan pwoteyin idantifye pa entansite peptide yo te bati lè l sèvi avèk pake a pheatmap (v1.0.12) nan R (v 4.1.2).Analiz anrichisman chemen yo te fèt lè l sèvi avèk baz done chemen Reactome pou pwoteyin trete IFNα ki te aktive plis pase kat fwa konpare ak echantiyon ki pa trete.
Idantifikasyon lysine (K) oswa serin (S) espesifik repwodiksyon chimik nan konplèks pwoteyin kontwole pa LC-MS / MS te fèt lè l sèvi avèk yon machin idantifikasyon espektroskopik (SIM-XL) pou peptides kwaze (SIM-XL)29.Premyèman, entèraksyon posib ant entèferon-asosye (IFN) ADN domaj rezistans siyati (IRDS) jèn yo te envestige lè l sèvi avèk done IRDS pwoteyin ki dekri nan Padariya et al.28.Depistaj tout kondisyon ak repete tout moun UniProt imen an entansif nan enfòmatik, kidonk tout baz done UniProt imen an (www.uniprot.org) (telechaje 12 out 2020, gen 75,093 antre) kont repetisyon IFNα-trete.Youn nan filtè yo pou entèraksyon konfyans segondè.Entèraksyon sa yo ki gen anpil enpòtans yo te elaji ak teste nan tout repetisyon ak kondisyon yo.
Nan SIM-XL, DSS yo te itilize pou crosslinker (XL) ak chanjman pwa XL ak chanjman pwa modifikasyon yo te mete nan 138.06 ak 156.07, respektivman.Yo konsidere sit reyaksyon retikizasyon sa yo: KK, KS ak KN-TERM, san iyon repòtè yo.Tou de ppm précurseur ak fragman yo te fikse a 20 ak papòt Xrea a te fikse a 0.15.Trypsin te konsidere kòm konplètman espesifik, epi yo te aplike yon metòd fragmentation C-trap (HCD) ki gen gwo enèji.Papòt rediksyon DB dinamik XCorr la ak kantite minimòm peptides pou rediksyon DB dinamik yo te fikse a 2.5 ak 2, respektivman.Lòt paramèt yo se: pwobabilite monoisotop ak koupe pik konyensidans, minimòm 4 résidus AA pou chak strand ak chaj maksimòm strand, ak 3 maksimòm fann rate.Kat jeyografik 2D koud yo te analize nan (SIM-XL) epi yo te itilize reprezantasyon grafik xQuest28 pou konstwi kat 2D yo.Pwoteyin crosslinks sou estrikti pwoteyin yo bay nan PyMol (PyMOL Molecular Graphics System, vèsyon 2.0 Schrödinger, LLC).
Estrikti modèl pwoteyin yo te kreye lè l sèvi avèk sèvè Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 lè l sèvi avèk prensip modèl omoloji ak aplikasyon "Metòd Hidden Markov".Phyre2 jenere estrikti modèl ki baze sou aliyman sekans ak estrikti pwoteyin li te ye.Pou pwoteyin H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4, ak MDN1, yo te itilize estrikti modèl 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62, ak 6i2665.Anplis de sa, estrikti AlphaFold71 MX1, UBP18 ak ROBO1 te konsidere tou.Yo te vizyalize estrikti pwoteyin nan lè l sèvi avèk pake BIOVIA Discovery Studio Visualizer (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, USA) ak pake Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Monreyal, Quebec, Kanada).