347 12.7 * 1.24mm Nerjaveèi asye mawonnen tib, mekanis molekilè nan kondansasyon elektwostatik synchrone ak coaggregation nan α-synuclein ak tau

Mèsi paske w vizite Nature.com.W ap itilize yon vèsyon navigatè ak sipò CSS limite.Pou pi bon eksperyans, nou rekòmande pou w sèvi ak yon navigatè ki ajou (oswa enfim mòd konpatibilite nan Internet Explorer).Anplis de sa, asire sipò kontinyèl, nou montre sit la san estil ak JavaScript.
Koulis ki montre twa atik pou chak glisad.Sèvi ak bouton dèyè yo ak bouton kap vini yo pou w deplase nan glisad yo, oswa bouton kontwolè glisad yo nan fen pou deplase nan chak glisad.

347 Nerjaveèi tiyo Spesifikasyon

347 12.7 * 1.24mm Nerjaveèi asye mawonnen tib

Dyamèt Deyò: 6.00 mm OD jiska 914.4 mm OD, Gwosè jiska 24” NB disponib ansyen stock, OD Size Steel Tubes disponib ansyen stock

SS 347 Tiyo epesè Range: 0.3mm - 50mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S, elatriye (0.5-12mm) Oswa gwosè ki pa regilye yo dwe pwepare jan sa nesesè

Kalite: SS 347 Tiyo san pwoblèm |SS 347 ERW Tiyo |SS 347 Tiyo soude |SS 347 Tiyo fabrike |SS 347 CDW Tib, LSAW Tiyo / Couture-soude / Redesine

Fòm: SS 347 Tiyo wonn / Tib, SS 347 Tiyo kare / Tib, SS 347 Tiyo rektangilè / Tib, SS 347 Tib mawonnen, SS 347 "U" fòm, SS 347 Pan Cake Coils, SS 347 Tib idwolik

Longè: Selibatè o aza, doub o aza & Longè obligatwa Fen: fen plen, fen bizote, treaded

Pwoteksyon fen: bouchon plastik |Fini deyò: 2B, No.4, No.1, No.8 Miwa Fini pou tiyo asye pur, Fini selon kondisyon kliyan

Kondisyon livrezon: rkwit ak marinated, poli, klere rkwit, frèt trase

Enspeksyon, Rapò Tès: Sètifika Tès Mill, EN 10204 3.1, Rapò Chimik, Rapò Mekanik, Rapò Tès PMI, Rapò Enspeksyon Vizyèl, Rapò Enspeksyon Twazyèm Pati, Rapò Laboratwa Apwouve NABL, Rapò Tès Destriktif, Rapò Tès ki pa Destriktif

Anbalaj: Chaje nan bwat an bwa, sache plastik, bann asye pake, oswa dapre demann kliyan yo.

Espesyalis: Gwosè ak Espesifikasyon lòt pase pi wo a ka fabrike sou demann

SS 347 Tiyo Size Range: 1/2 pous NB, OD a 24 pous

ASTM A312 347: Seamless ak kouti dwat soude tiyo austenitic gen entansyon pou tanperati ki wo ak sèvis jeneral korozivite.Filler metal pa pèmèt pandan soude.

ASTM A358 347: Fizyon elektrik soude tiyo austenitic pou sèvis korozivite ak / oswa segondè tanperati.Tipikman sèlman tiyo jiska 8 pous pwodui nan spesifikasyon sa a.Yo pèmèt ajoute metal filler pandan soude.

ASTM A790 347: Seamless ak kouti dwat soude feritik / austenitic (duplex) tiyo ki gen entansyon pou sèvis jeneral korozivite, ak yon anfaz patikilye sou rezistans nan krak korozyon estrès.

ASTM A409 347: Fizyon elektrik kouti dwat oswa espiral soude gwo dyamèt austenitic limyè-miray tiyo nan gwosè 14 "a 30" ak mi Sch5S ak Sch 10S pou korozivite ak / oswa segondè.

ASTM A376 347: Tiyo austenitic san pwoblèm pou aplikasyon pou tanperati ki wo.

ASTM A813 347: Selibatè, yon sèl-oswa doub-soude tiyo austenitic pou tanperati ki wo ak aplikasyon jeneral korozivite.

ASTM A814 347: Fwad-travay soude tiyo austenitic pou tanperati ki wo ak sèvis jeneral korozivite.

347H Nerjaveèi asye tiyo konpozisyon chimik

Nerjaveèi asye 347H tiyo pwopriyete mekanik

Nerjaveèi asye 347H tiyo pwopriyete fizik

Klas ekivalan pou 347H Nerjaveèi asye tiyo

Agregasyon amiloid alfa-synuclein (αS) se yon karakteristik maladi Parkinson la ak lòt sinukleinopati.Dènyèman, pwoteyin tau ki souvan asosye ak maladi alzayme a te asosye ak patoloji αS epi li te jwenn ko-lokalize nan enklizyon αS ki rich, byenke mekanis molekilè coaggregation de pwoteyin yo rete klè.Nou rapòte isit la ke faz αS separe an kondansasyon likid atravè kondansasyon konplèks elektwostatik ak polipèptid ki chaje pozitivman tankou tau.Tou depan de afinite αS pou polycations ak to rediksyon valans rezo coagulation, boul sibi rapid jelasyon oswa coalescence ki te swiv pa agrégation amiloid dousman.Lè nou konbine yon seri teknik byofizik avanse, nou te kapab karakterize separasyon faz likid-likid αS/Tau epi idantifye faktè kle ki mennen nan fòmasyon granul etewojèn ki gen tou de pwoteyin nan yon kondansasyon pwoteyin likid.
Anplis de konpatiman manbràn, separasyon espasyal nan selil yo ka reyalize tou pa fòmasyon nan kò ki rich nan pwoteyin, ki tankou likid ki rele kondansasyon biomolekilè oswa ti gout, atravè yon pwosesis ke yo rekonèt kòm separasyon faz likid-likid (LLPS).Ti gout sa yo fòme pa entèraksyon tanporèl miltivalan, anjeneral ant pwoteyin oswa pwoteyin ak RNA, epi sèvi yon varyete de fonksyon nan prèske tout sistèm k ap viv.Yon gwo kantite pwoteyin LLP-kapab montre sekans konpleksite ki ba ki trè dezòdone nan lanati ak nan fòmasyon kondansasyon biomolekilè3,4,5.Anpil etid eksperimantal te revele nati fleksib, souvan dezòdone, ak miltivalan nan pwoteyin ki fòme kondansasyon likid sa yo, byenke yo konnen ti kras sou detèminan espesifik molekilè ki kontwole kwasans ak spirasyon kondansasyon sa yo nan yon kondansasyon ki pi solid. eta..
Nouvo done yo sipòte ipotèz LLPS aberan ki baze sou pwoteyin ak transfòmasyon ti gout nan estrikti solid yo ka chemen selilè enpòtan ki mennen nan fòmasyon total toksik ki pa ka fonn ki souvan karakteristik maladi dejeneratif.Anpil LLPS-asosye pwoteyin intrinsèque dezòdone (IDPs), souvan trè chaje ak fleksib, yo te asosye depi lontan ak neurodegeneration atravè pwosesis la nan agrégation amiloid.An patikilye, kondansasyon biomolekilè IDP tankou FUS7 oswa TDP-438 oswa pwoteyin ki gen gwo domèn konpleksite ki ba tankou hnRNPA19 yo te montre yo laj nan fòm jèl oswa menm fòm solid atravè yon pwosesis ki rele fluidization.konpoze.nan tranzisyon faz solid (LSPT) kòm yon fonksyon tan oswa an repons a sèten modifikasyon apre-tradiksyon oswa mitasyon patolojik enpòtan1,7.
Yon lòt IDP ki asosye ak LLPS in vivo se Tau, yon pwoteyin dezòd ki asosye ak mikrotubule ki gen agregasyon amiloid ki te enplike nan maladi alzayme a 10 men li te tou dènyèman te enplike nan maladi Parkinson la (PD) ak lòt proteinopati nikleyè sinaptik 11, 12, 13 ki gen rapò.Yo te montre Tau espontaneman disoye soti nan solisyon / sitoplasm akòz entèraksyon elèktrostatik favorab14, sa ki lakòz fòmasyon nan ti gout ki anrichi tau ke yo rekonèt kòm coacervates elektwostatik.Li te tou obsève ke sa a ki kalite entèraksyon ki pa espesifik se fòs la kondwi dèyè anpil kondansasyon biomolekilè nan lanati15.Nan ka a nan yon pwoteyin tau, agrégation elektwostatik ka fòme pa agrégation senp, nan ki rejyon chaje opoze nan pwoteyin nan deklanche pwosesis la klivaj, oswa pa agrégation konplèks atravè entèraksyon ak polymère chaje negatif tankou RNA.
Dènyèman, α-synuclein (αS), yon IDP amyloid ki enplike nan PD ak lòt maladi neurodegenerative ke yo rekonèt kolektivman kòm synucleinopathy17,18, te demontre nan modèl selilè ak bèt19,20 konsantre nan kondansasyon pwoteyin ak konpòtman ki sanble ak likid.Etid in vitro yo te montre ke αS sibi LLPS pa agrégation senp atravè entèraksyon prensipalman idrofob, byenke pwosesis sa a mande pou konsantrasyon pwoteyin eksepsyonèlman wo ak tan enkubasyon atipik long19,21.Kit αS ki gen kondansasyon yo obsève nan vivo yo fòme pa sa a oswa lòt pwosesis LLPS rete yon pwoblèm kle ki poko rezoud.Menm jan an tou, byenke yo te obsève agregasyon amiloid αS nan newòn nan PD ak lòt sinukleinopati, mekanis egzak kote αS sibi agrégation amiloid entraselilè rete klè, paske twòp ekspresyon nan pwoteyin sa a pa parèt deklanche pwosesis sa a poukont li.Gen plis domaj selilè souvan obligatwa, ki sijere ke sèten kote selilè oswa mikro-anviwònman yo obligatwa pou renucleation nan asanble amiloid αS entraselilè.Youn nan anviwònman selilè ki patikilyèman gen tandans fè agrégasyon ka anndan kondansasyon pwoteyin yo 23 .
Enteresan, αS ak tau yo te jwenn ko-lokalize nan enklizyon maladi karakteristik nan moun ki gen maladi Parkinson la ak lòt sinukleinopati 24,25 ak eksperyans yo te rapòte yon relasyon sinèrjetik patolojik ant de pwoteyin yo 26,27 sijere yon relasyon potansyèl ant agrégasyon αS ak tau nan maladi neurodegenerative.maladi.αS ak tau yo te jwenn yo kominike ak ankouraje agrégation youn ak lòt nan vitro ak nan vivo 28,29 ak total heterogeneous ki konpoze de de pwoteyin sa yo yo te obsève nan sèvo yo nan pasyan ki gen synucleinopathies 30 .Sepandan, yo konnen ti kras sou baz molekilè nan entèraksyon ki genyen ant αS ak tau ak mekanis nan ko-agregasyon li yo.Yo te rapòte ke αS kominike avèk tau atravè yon atraksyon elektwostatik ant rejyon C-tèminal trè negatif chaje nan αS ak rejyon santral tau ki rich nan proline, ki se tou rich nan résidus chaje pozitivman.
Nan etid sa a, nou montre ke αS ka tout bon disosye nan ti gout atravè kondansasyon konplèks elektwostatik nan prezans pwoteyin tau, kontrèman ak entèraksyon li yo ak lòt polipèptid ki chaje pozitivman tankou poly-L-lysine (pLK), ak nan pwosesis sa a.αS aji kòm yon molekil echafodaj pou rezo ti gout.Nou te idantifye diferans aparan nan pwosesis la nan spirasyon nan coacervates elèktrostatik αS, ki asosye ak diferans ki genyen nan valens la ak fòs nan entèraksyon an nan pwoteyin ki enplike nan rezo a coacervate.Enteresan, nou te obsève ko-agregasyon nan αS ak tau pwoteyin amiloid nan coacervat likid ki dire lontan epi yo te idantifye kèk faktè kle ki mennen nan ko-agregasyon nan de pwoteyin sa yo nan coacervats sa yo.Isit la nou dekri an detay pwosesis sa a, ki se yon mekanis molekilè posib ki kache colocalization de pwoteyin nan enklizyon maladi espesifik.
αS gen yon ke trè anionik C-tèminal nan pH net (figi 1a), epi nou te ipotèz ke li ta ka sibi LLPS atravè kondansasyon konplèks elektwostatik ak molekil polipèptid polycationic dezòd.Nou te itilize yon poly-L-lysine 100-résid (pLK) kòm molekil modèl kòmanse akòz nati polymère pozitif ak dezòdone li nan pH net 32. Premyèman, nou konfime ke pLK reyaji ak domèn Ct nan αS atravè Spèktroskopi Solisyon NMR. (Figi 1b) lè l sèvi avèk 13C / 15N ki make αS nan prezans ogmante αS: pLK rapò molè.Entèraksyon pLK ak domèn Ct nan αS manifeste tèt li nan perturbasyon chanjman chimik la ak yon diminisyon nan entansite pik nan rejyon sa a nan pwoteyin lan.Enteresan, lè nou melanje αS ak pLK nan yon konsantrasyon αS nan approx.5-25 µM nan prezans polyethylene glycol (5-15% PEG-8) (tanpon LLPS tipik: 10 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl, 15% PEG-8) nou imedyatman te ale nan yon gwo domèn fòmasyon pwoteyin. .ti gout yo te obsève lè l sèvi avèk fliyoresans (WF) ak mikwoskòp klere-jaden (BF) (figi 1c).1-5 µm ti gout ki gen αS konsantre (te ajoute 1 µM AlexaFluor488 ki make αS, AF488-αS), pwopriyete elektwostatik yo ka sòti nan rezistans yo nan 10% 1,6-hexanediol (1,6-HD) ak sansiblite li nan yon ogmantasyon nan konsantrasyon NaCl (Fig. 1c).Se nati a likid ki sanble nan coacervates yo nan αS / pLK konplèks elektwostatik demontre pa kapasite yo nan fusion nan milisgond (figi 1d).Sèvi ak turbidimetri, nou mezire fòmasyon ti gout anba kondisyon sa yo, konfime nati elektwostatik entèraksyon prensipal ki asosye ak estabilite li yo (figi 1e), epi evalye efè divès rapò polymère sou pwosesis LLPS la (figi 1f).Malgre ke fòmasyon ti gout yo obsève sou yon pakèt rapò polymère, pwosesis la trè favorab lè pLK depase αS.LLP yo te obsève tou lè l sèvi avèk pwodui chimik diferan ajan deplasman dextran-70 (70 kDa) oswa lè l sèvi avèk yon varyete fòma echantiyon, ki gen ladan gout glise vè, pwi microplate nan divès kalite materyèl, Eppendorf oswa kapilè kwatz.
yon reprezantasyon Schematic nan diferan rejyon pwoteyin nan varyant WT-αS ak ΔCt-αS yo itilize nan etid sa a.Domèn N-tèminal anfipatik la, rejyon ki fòme amiloid idrofob (NAC), ak domèn C-terminal ki chaje negatif yo montre an ble, zoranj ak wouj, respektivman.Yo montre kat jeyografik Net Charge Pa Residual (NCPR) WT-αS.b NMR analiz de entèraksyon αS/pLK nan absans makromolekilè.Kòm konsantrasyon pLK ogmante (αS:pLK molè rapò 1:0.5, 1:1.5, ak 1:10 yo montre nan vèt limyè, vèt, ak vèt fonse, respektivman).c Coacervate αS/pLK (rapò molè 1:10) nan 25 µM (1 µM AF488-etikèt αS oswa Atto647N-etikèt pLK pou WF D) nan tanpon LLPS (anwo) oswa konplete ak 500 mM NaCl (anba goch) oswa apre 110. % 1,6-hexanediol (1,6-HD; anba adwat).Ba echèl = 20 µm.d Imaj mikwoskopik reprezantan fizyon ti gout BF nan αS/pLK (rapò molè 1:10) nan yon konsantrasyon 25 μM;flèch yo endike fusion endividyèl gout (flèch wouj ak jòn) nan yon nouvo gout (flèch zoranj) nan 200 ms).Ba echèl = 20 µm.e Limyè gaye (nan 350 nm) αS/pLK agrégation nan tanpon LLPS anvan ak apre adisyon 500 mM NaCl oswa 10% 1,6-HD nan 25 µM αS (N = 3 echantiyon replike, vle di ak devyasyon estanda tou endike).f BF imaj (anwo) ak analiz gaye limyè (nan 350 nm, anba) nan αS / pLK agrégation nan 25 μM αS ak ogmante αS: pLK rapò molè (N = 3 echantiyon replike, vle di ak devyasyon estanda tou endike).Ba echèl = 10 µm.Ba echèl la sou yon imaj endike echèl tout imaj nan yon panèl.Done kri yo bay sou fòm dosye done kri.
Dapre obsèvasyon nou yo nan kondansasyon konplèks elektwostatik αS/pLK ak obsèvasyon anvan yo nan αS kòm yon molekil kliyan nan kondansasyon tau/RNA atravè entèraksyon dirèk ak tau31, nou te sipoze ke αS ak tau te kapab separe ak sòlvan an nan absans RNA. kondansasyon.atravè konplèks elektwostatik, ak αS se pwoteyin echafodaj la nan αS/Tau coacervates (gade distribisyon chaj tau nan Figi 2e).Nou te obsève ke lè 10 μM αS ak 10 μM Tau441 (ki gen 1 μM AF488-αS ak 1 μM Atto647N-Tau, respektivman) yo te melanje ansanm nan tanpon LLPS, yo fasil fòme total pwoteyin ki gen tou de pwoteyin, jan yo wè pa WF mikwoskòp.(Fig. 2a).Kokalizasyon de pwoteyin yo nan ti gout yo te konfime pa mikwoskopi konfokal (CF) (figi siplemantè 1a).Konpòtman menm jan an te obsève lè dextran-70 te itilize kòm yon ajan agrégation (Siplemantè Fig. 1c).Sèvi ak swa FITC ki make PEG oswa dextran, nou te jwenn ke tou de ajan foul moun yo te distribye respire atravè echantiyon yo, ki montre ni segregasyon ni asosyasyon (figi siplemantè 1d).Olye de sa, li sijere ke nan sistèm sa a yo ankouraje separasyon faz atravè efè makromolekilè foul moun, depi PEG se yon ajan foul preferansyèlman ki estab, jan yo wè nan lòt sistèm LLP33,34.Ti gout sa yo ki rich nan pwoteyin yo te sansib a NaCl (1 M), men se pa 1,6-HD (10% v / v), konfime pwopriyete elektwostatik yo (figi siplemantè 2a, b).Yo te konfime konpòtman likid yo lè yo obsève evènman ti gout fusion milisgond lè l sèvi avèk mikwoskospi BF (Fig. 2b).
yon imaj mikwoskopi konfokal (CF) nan αS/Tau441 coacervates nan tanpon LLPS (10 μM nan chak pwoteyin, 0.5 μM nan AF488 ki make αS ak Atto647N ki make Tau441).b Reprezantatif diferans entèferans kontras (DIC) imaj nan evènman fizyon ti gout αS/Tau441 (10 μM pou chak pwoteyin).c Dyagram faz ki baze sou gaye limyè (nan 350 nm) Tau441 LLPS (0–15 µM) nan absans (agòch) oswa prezans (adwat) 50 µM αS.Koulè pi cho yo endike plis gaye.d Limyè gaye echantiyon αS/Tau441 LLPS ak ogmante konsantrasyon αS (Tau441 nan 5 µM, N = 2–3 repetisyon echantiyon jan sa endike).e Reprezantasyon eskematik kèk varyant pwoteyin tau ak diferan rejyon nan pwoteyin yo itilize nan etid sa a: domèn N-tèminal ki chaje negatif (wouj), rejyon ki rich nan prolin (ble), domèn ki konekte mikrotubule (MTBD, make an zoranj), ak espiral pè ki fòme amiloid.rejyon filaman (PHF) ki sitiye nan MTBD a (gri).Yo montre kat jeyografik Net Charge Pa Residue (NCPR) Tau441.f Sèvi ak 1 µM AF488 ki make αS ak Atto647N ki make ΔNt-, lè l sèvi avèk 1 µM AF488 ki make αS oswa ΔCt-αS nan prezans ΔNt-Tau (anwo, 10 µM pou chak pwoteyin) oswa K18 (anba, µM pou chak pwoteyin). ) ) ) mikrografi WF kondanse nan tanpon LLPS oswa K18.Ba echèl yo nan yon imaj reprezante echèl tout imaj nan yon sèl panèl (20 µm pou panno a, b ak f).Done kri pou panno c ak d yo bay kòm dosye done anvan tout koreksyon.
Pou teste wòl αS nan pwosesis LLPS sa a, nou premye envestige efè αS sou estabilite ti gout pa nefelometri lè l sèvi avèk ogmantasyon konsantrasyon NaCl (Fig. 2c).Pi gwo konsantrasyon sèl nan echantiyon ki gen αS, se pi wo valè limyè gaye (nan 350 nm), ki endike wòl estabilize αS nan sistèm LLPS sa a.Yon efè menm jan an ka obsève lè w ogmante konsantrasyon αS (e pakonsekan rapò αS:Tau441) a approx.Ogmantasyon 10 fwa parapò ak konsantrasyon tau (5 µM) (Fig. 2d).Pou demontre ke αS se yon pwoteyin echafodaj nan coacervates, nou deside mennen ankèt sou konpòtman Tau mutan LLPS ki deranje, ki manke yon rejyon N-tèminal chaje negatif (résid 1-150, gade Fig. 2e) ki rele ΔNt-Tau.WF mikwoskopi ak nefelometri konfime ke ΔNt-Tau tèt li pa t 'sibi LLPS (Fig. 2f ak Fig. Siplemantè 2d), jan yo te rapòte deja 14. Sepandan, lè αS te ajoute nan solisyon dispèsyon nan sa a varyant Tau tronke, pwosesis LLPS la te konplètman. retabli ak dansite ti gout tou pre dansite ti gout nan solisyon plen gwosè nan Tau ak αS nan kondisyon ki sanble ak konsantrasyon pwoteyin.Pwosesis sa a ka obsève tou nan kondisyon ki ba makromolekilè (figi siplemantè 2c).Wòl rejyon αS C-tèminal la, men se pa tout longè li, nan pwosesis LLPS la te demontre pa anpèchman fòmasyon ti gout lè l sèvi avèk yon variant C-tèminal αS tronke ki manke rezidi 104-140 (figi 1a) nan (ΔCt-). αS) pwoteyin (figi 2f ak Figi siplemantè 2d).Kokalizasyon αS ak ΔNt-Tau te konfime pa mikwoskòp fliyoresan konfokal (figi siplemantè 1b).
Pou plis teste mekanis LLPS ant Tau441 ak αS, yo te itilize yon variante Tau adisyonèl, sètadi fragman nwayo filaman helical pè (PHF) nan domèn nan mikrotubule-obligatwa (MTBD), ki si li gen kat domèn repete karakteristik, souvan konnen tou. kòm fragman K18 la (gade Fig. 2e).Li te fèk rapòte ke αS preferansyèlman mare nan yon pwoteyin tau ki sitiye nan yon domèn ki rich nan prolin nan yon sekans ki vin anvan domèn nan microtubule-obligatwa.Sepandan, rejyon PHF la tou rich nan résidus pozitivman chaje (gade Figi 2e), espesyalman lizin (15% résidus), ki te pouse nou teste si rejyon sa a tou kontribye nan kondansasyon nan konplèks αS/Tau.Nou te obsève ke K18 pou kont li pa t 'kapab deklanche LLPS nan konsantrasyon jiska 100 μM nan kondisyon yo teste (tanpon LLPS ak 15% PEG oswa 20% dextran) (Figi 2f).Sepandan, lè nou te ajoute 50 µM αS a 50 µM K18, yo te obsève fòmasyon rapid nan ti gout pwoteyin ki gen K18 ak αS pa nefelometri (figi siplemantè 2d) ak mikwoskòp WF (figi 2f).Kòm espere, ΔCt-αS pa t 'kapab retabli konpòtman an LLPS nan K18 (Fig. 2f).Nou sonje ke agrégation αS/K18 mande pou yon ti kras pi wo konsantrasyon pwoteyin pou pwovoke LLPS konpare ak αS/ΔNt-Tau oswa αS/Tau441, lòt bagay yo egal.Sa a se ki konsistan avèk yon entèraksyon pi fò nan rejyon an αS C-tèminal ak domèn nan Tau ki rich pwolin konpare ak domèn nan microtubule-obligatwa, jan sa dekri deja 31 .
Etandone ke ΔNt-Tau pa ka fè LLPS nan absans αS, nou te chwazi Variant Tau sa a kòm yon modèl pou karakterize αS / Tau LLPS bay senplisite li nan sistèm LLPS ak Tau plen longè (izotip, Tau441 / Tau441).ak pwosesis agrégation konplèks (eterotipik, αS/Tau441).Nou te konpare degre agrégation αS (kòm yon pati nan pwoteyin faz kondanse, fαS,c) nan sistèm αS/Tau ak αS/ΔNt-Tau pa santrifijasyon ak analiz SDS-PAGE faz dispèse (gade 2e), yo te jwenn valè ki sanble anpil. pou tout pwoteyin nan menm konsantrasyon.An patikilye, nou te jwenn fαS,c 84 ± 2% ak 79 ± 7% pou αS/Tau ak αS/ΔNt-Tau, respektivman, sijere ke entèraksyon an heterotypic ant αS ak tau siperyè entèraksyon ki genyen ant molekil tau.ant.
Entèraksyon ak divès kalite polycations ak efè pwosesis kondansasyon an sou sinetik αS yo te premye etidye pa metòd rekiperasyon fliyoresan apre photobleaching (FRAP).Nou teste αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau ak αS/pLK coacervates (100 μM αS konplete ak 2 μM αS AF488-αS ak 100 μM Tau441 oswa ΔNt-Tau oswa 1 mM pLK).Done yo te jwenn nan premye 30 minit yo apre yo fin melanje eleman echantiyon yo.Soti nan imaj reprezantan FRAP yo (figi 3a, kondansasyon αS/Tau441) ak koub tan korespondan yo (figi 3b, Figi siplemantè 3), li ka wè ke sinetik αS yo sanble anpil ak sa yo ki nan coacervates Tau441.ak ΔNt-Tau, ki pi rapid ak pLK.Koefisyan difizyon kalkile pou αS andedan coacervate a dapre FRAP (jan Kang et al. 35 dekri) se D = 0.013 ± 0.009 µm2/s ak D = 0.026 ± 0.008 µm2/s pou αS/Tau441 ak αNt-S pou/Δ sistèm αS/.pLK, Tau, ak D = 0.18 ± 0.04 µm2 / s, respektivman (figi 3c).Sepandan, koyefisyan difizyon αS nan faz dispèse a se plizyè lòd nan grandè ki pi wo pase tout faz kondanse, jan yo detèmine pa Spèktroskopi korelasyon Fluoresans (FCS, gade Figi Siplemantè 3) nan menm kondisyon yo (tanpon LLPS) men nan absans polycations. (D = 8 ± 4 µm2/s).Se poutèt sa, sinetik nan tradiksyon αS siyifikativman redwi nan coacervates konpare ak pwoteyin nan faz la dispèse akòz pwononse efè foul moun molekilè, byenke tout coacervates kenbe pwopriyete likid ki tankou pandan premye mwatye èdtan apre fòmasyon yo, nan Kontrèman ak faz tau a.pi vit sinetik nan kondansasyon pLK.
a–c FRAP analiz de dinamik αS (2% AF488 ki make αS) nan coacervats elektwostatik.Imaj reprezantatif nan tès αS/Tau441 FRAP yo montre nan (a), kote ti sèk wouj yo endike zòn ki dekolorize.Ba echèl la se 5 µm.b Mwayèn koub FRAP ak (c) koyefisyan difizyon kalkile (D) pou 5–6 (N) ti gout diferan ki soti nan twa eksperyans lè l sèvi avèk 100 µM αS ak konsantrasyon ekimolè Tau441 (wouj) oswa ΔNt-Tau (ble) oswa pLK (vèt) nan dis fwa konsantrasyon nan LLPS.Devyasyon estanda koub FRAP la montre nan koulè fonse.Pou konparezon, yo te detèmine koyefisyan difizyon αS nan faz dispèse an triple lè l sèvi avèk spèktroskopi korelasyon fluoresans (FCS) (gade Figi Siplemantè 3 ak metòd pou plis enfòmasyon).d Kontini X-band EPR spectre nan 100 μM TEMPOL-122-αS nan tanpon LLPS san okenn polycation (nwa) oswa nan prezans 100 μM Tau441 (wouj) oswa ΔNt-Tau (ble) oswa 1 mM pLK (vèt).Ankadreman an montre yon gade agrandi sou liy jaden fò kote chanjman ki pi dramatik yo rive.e Koub Liaison 50 μM TEMPOL-122-αS ak plizyè polycations nan absans LLPS (pa gen PEG).Anplitid redwi nan gwoup III konpare ak gwoup II (IIII/III) nan spectre EPR nòmalize a montre ogmante rapò molè Tau441 (wouj), ΔNt-Tau (ble) ak pLK (vèt).Liy ki gen koulè yo montre anfòm nan done yo lè l sèvi avèk yon modèl obligatwa ki graj ak n sit ki idantik ak endepandan sou chak koub.Done kri yo bay sou fòm dosye done kri.
Kòm yon konpleman, nou te envestige dinamik αS nan divès kalite coacervats lè l sèvi avèk etikèt vire dirije (SDSL) ak sonorite elèktron paramayetik kontinyèl (CW-EPR).Metòd sa a pwouve yo dwe trè itil nan rapò fleksibilite ak dinamik nan IDP a ak yon rezolisyon rezidyèl reyalis36,37,38.Pou sa ka fèt, nou te konstwi rès sistein nan yon sèl mutan Cys epi nou te itilize sond spin 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPOL).Maleimide dérivés make yo.Plis espesyalman, nou mete sond TEMPOL nan pozisyon 122 oswa 24 αS (TEMPOL-122-αS ak TEMPOL-24-αS).Nan premye ka a, nou vize rejyon C-tèminal pwoteyin lan, ki enplike nan entèraksyon ak polycations.Olye de sa, pozisyon 24 ka ba nou enfòmasyon sou dinamik jeneral pwoteyin yo nan kondansasyon an.Nan de ka yo, siyal EPR yo jwenn pou pwoteyin faz dispèse yo te koresponn ak radikal nitroksid nan eta k ap deplase rapid.Apre separasyon faz nan prezans tau oswa pLK (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 oswa ΔNt-Tau nan yon rapò 1:1 oswa pLK nan yon rapò 1:10), yo te obsève yon ogmantasyon nan entansite pik relatif la. spectre EPR nan αS.Liy pèt la elaji, ki endike sinetik reoryantasyon αS redwi nan ti gout konpare ak pwoteyin nan faz dilye (figi 3d, Figi siplemantè 4a).Chanjman sa yo pi pwononse nan pozisyon 122. Pandan ke nan pozisyon 24 prezans nan pLK pa te afekte sinetik sond la, nan pozisyon 122 fòm nan liy espèk chanje anpil (figi siplemantè 4a).Lè nou te eseye modèl espèk yo nan pozisyon 122 nan de sistèm αS / polikasyon lè l sèvi avèk modèl izotwòp (figi siplemantè 5a) souvan itilize pou dekri dinamik IDP38,39 ki make vire, nou pa t kapab rekonstwi espèk eksperimantal yo..Spectral simulation nan pozisyon nan 24 vire diferansye (Siplemantè Fig. 5a).Sa a sijere ke gen pozisyon preferansyèl nan espas ki la nan konfigirasyon vire nan rejyon an C-tèminal nan αS nan prezans polycations.Lè w ap konsidere fraksyon nan αS nan faz kondanse a anba kondisyon eksperimantal EPR (84 ± 2%, 79 ± 7%, ak 47 ± 4% pou αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau, ak αS/pLK, respektivman-gade Siplemantè Fig. 2e nan analiz done c), li ka wè ke elajisman an detekte pa metòd la EPR sitou reflete entèraksyon an nan rejyon an C-tèminal nan αS ak divès kalite polycations nan faz nan kondanse (chanjman prensipal la lè w ap itilize TEMPOL-122- αS), epi yo pa kondansasyon pwoteyin.Yo obsève yon ogmantasyon nan mikroviskozite nan sond la.Kòm espere, spectre EPR nan pwoteyin nan nan kondisyon lòt pase LLPS te konplètman retabli lè yo te ajoute 1 M NaCl nan melanj lan (Siplemantè Figi 4b).An jeneral, done nou yo sijere ke chanjman yo detekte pa CW-EPR sitou reflete entèraksyon an nan rejyon an C-tèminal nan αS ak divès kalite polycations nan faz nan kondanse, ak entèraksyon sa a parèt pi fò ak pLK pase ak Tau.
Yo nan lòd yo jwenn plis enfòmasyon estriktirèl sou pwoteyin yo nan coacervate a, nou deside etidye sistèm LLPS la lè l sèvi avèk NMR nan solisyon.Sepandan, nou te kapab sèlman detekte fraksyon αS ki rete nan faz dispèse, ki ka akòz dinamik pwoteyin redwi andedan coacervate la ak yon faz dans nan pati anba solisyon an nan analiz NMR.Lè nou analize estrikti a ak dinamik pwoteyin ki rete nan faz dispèse echantiyon LLPS la lè l sèvi avèk NMR (figi siplemantè 5c, d), nou remake ke pwoteyin nan te konpòte prèske idantik nan prezans pLK ak ΔNt-Tau, tou de nan. ki te nan estrikti segondè ak dinamik nan zo rèl do pwoteyin, revele pa eksperyans sou chanjman chimik segondè ak detant R1ρ.Done NMR yo montre ke C-tèminal αS soufri yon pèt enpòtan nan fleksibilite konformasyon pandan y ap kenbe nati dezòd li yo, tankou rès la nan sekans pwoteyin, akòz entèraksyon li yo ak polycations.
Piske elajisman siyal CW-EPR yo obsève nan faz kondansasyon TEMPOL-122-αS reflete entèraksyon pwoteyin nan ak polycations, nou te fè yon titrasyon EPR pou evalye afinite lyezon αS ak divès polications nan absans LLPS (pa gen okenn akimilasyon. Tanpon LLPS), sijere ke entèraksyon yo se menm bagay la nan faz dilye ak konsantre (ki konfime pa done nou an, Figi Siplemantè 4a ak Figi Siplemantè 6).Objektif la se te wè si tout coacervates, malgre pwopriyete komen ki sanble ak likid yo, montre nenpòt konpòtman diferans ki kache nan nivo molekilè.Kòm espere, spectre EPR la elaji ak ogmante konsantrasyon polycation, ki reflete yon diminisyon nan fleksibilite molekilè akòz entèraksyon molekilè nan tout patnè entèraksyon prèske nan saturation (figi 3e, Figi siplemantè 6).pLK reyalize saturation sa a nan yon rapò molè ki pi ba (polication:αS) konpare ak ΔNt-Tau ak Tau441.An reyalite, konparezon done yo ak yon modèl obligatwa apwoksimatif sipoze n sit obligatwa ki idantik ak endepandan te montre ke konstan disosyasyon aparan pLK (~ 5 μM) se yon lòd nan grandè pi ba pase sa yo ki nan Tau441 oswa ΔNt-Tau (~ 50 μM). ).µM).Malgre ke sa a se yon estimasyon ki graj, sa sijere ke αS gen yon pi gwo afinite pou polications ki pi senp ak rejyon chaj pozitif kontinyèl.Bay diferans sa a nan afinite ant αS ak divès kalite polycations, nou te sipoze ke pwopriyete likid yo ka chanje yon fason diferan sou tan epi kidonk soufri soti nan diferan pwosesis LSPT.
Etandone anviwònman an ki gen anpil moun nan coacervate nan pwoteyin ak nati amiloid nan pwoteyin nan, nou obsève konpòtman an nan coacervate a sou tan yo detekte posib pwosesis LSPT.Sèvi ak mikwoskòp BF ak CF (Figi 4), nou te obsève ke αS / Tau441 coacervates nan yon gwo limit nan solisyon, fòme gwo ti gout ki kontakte ak mouye sifas la nan pati anba a nan pi / glisad kòm ti gout plen, jan yo espere (figi siplemantè). .7d);nou rele sa yo estrikti anba-fòme "kannòt pwoteyin".Estrikti sa yo te rete likid pandan yo te kenbe kapasite pou yo fusion (figi siplemantè 7b) epi yo ka wè pandan plizyè èdtan apre LLPS te deklanche (figi 4 ak figi siplemantè 7c).Nou te obsève ke pwosesis la mouye favorize sou sifas la nan idrofil olye ke materyèl idrofob (Siplemantè Fig. 7a), jan yo espere pou coacervates elektwostatik ak chaj dezekilib e konsa segondè potansyèl sifas elektwostatik.Miyò, αS/ΔNt-Tau coalescence ak rafting te siyifikativman redwi, pandan y ap αS/pLK kondansasyon yo te siyifikativman redwi (Fig. 4).Pandan tan kout enkubasyon, ti gout αS/pLK yo te kapab kole ak mouye sifas idrofil la, men pwosesis sa a byen vit sispann epi apre 5 èdtan nan enkubasyon, yo te obsève sèlman evènman coalescence limite epi pa gen okenn mouye.- tranzisyon jèl-degoute.
Reprezantan BF (panno echèl gri) ak CF (panno adwat, AF488 ki make αS an vèt) nan echantiyon coacervate ki gen 100 µM αS (1% etikèt fliyoresan) nan tanpon LLPS nan prezans 100 µM Tau441 (anwo) imaj fliyoresan ΔN mikwoskopik. -Tau (sant) oswa 1 mM pLK (anba) nan tan enkubasyon diferan ak wotè fokal (z, distans anba a nan plak la byen).Eksperyans yo te repete 4-6 fwa poukont youn ak lòt ak menm rezilta yo.αS/Tau441 coacervats yo mouye apre 24 èdtan, fòme kannòt ki pi gwo pase imaj la.Ba echèl la pou tout imaj se 20 µm.
Lè sa a, nou te mande si gwo likid ki tankou pisin pwoteyin ki te fòme nan αS/Tau441 LLPS ta mennen nan agrégation amiloid nan nenpòt nan pwoteyin yo etidye.Nou swiv spirasyon ti gout αS/Tau441 sou tan ak mikwoskospi WF nan menm kondisyon ak pi wo a, men lè l sèvi avèk 1 μM AF488 ki make αS ak Atto647N ki make Tau441 (figi 5a).Kòm espere, nou obsève lokalizasyon konplè pwoteyin nan tout pwosesis spirasyon an.Enteresan, soti nan ca.Apre 5 èdtan, yo te obsève estrikti pi entans ki pa sikilè andedan kannòt yo, ke nou te rele "pwen", kèk nan yo te colocalized ak αS, ak kèk yo te rich nan Tau441 (Fig. 5a, flèch blan).Tach sa yo te toujou obsève nan kannòt yo nan yon pi gwo limit pou αS/ΔNt-Tau pase pou αS/ΔNt-Tau.Pa te gen okenn tach diferan nan ti gout nan pLK ak Tau sistèm enkonpetan pou fizyon / mouye.Pou teste si tach sa yo ki gen αS ak Tau441 yo se granul ki sanble ak amiloid, nou te fè yon eksperyans menm jan an lè l sèvi avèk mikwoskòp CF kote Tau441 te make ak Atto647N ak 12.5 μM amyloid-espesifik thioflavin-T (ThT) te ajoute depi nan kòmansman an.lank.Malgre ke ThT-tach nan αS/Tau441 ti gout oswa kannòt yo pa te obsève menm apre 24 èdtan nan enkubasyon (Fig. 5b, ranje tèt-rete ti gout sou kannòt pwoteyin), estrikti ThT-pozitif ki gen Atto647N-Tau441 andedan kannòt yo te trè fèb.sa a repwodui gwosè, fòm, ak kote tach yo dekri deja (figi 5b, mitan ak ranje anba), sijere ke tach yo ka koresponn ak granul amiloid ki te fòme nan coacervat likid ki aje.
WF 25 μM αS nan plizyè fwa enkubasyon ak wotè fokal (z, distans soti nan anba unbound) nan prezans 25 μM Tau441 (1 μM AF488 ki make αS ak Atto647N ki make Tau441) nan yon pi nan yon plak mikwoskòp ak tanpon LLPS) .Sis eksperyans yo te repete poukont yo ak rezilta menm jan an.b CF imaj mikwoskopik nan 25 μM αS nan prezans 25 μM Tau441 (1 μM Atto647N ki make Tau441) ak 12.5 μM thioflavin-T (ThT).Yo montre ti gout pwoteyin ki pondéré yo ak kannòt pwoteyin ki depoze ak tach yo nan ranje anwo ak mitan yo, respektivman.Ranje anba a montre imaj kannòt ak gout ki soti nan 3 kopi endepandan.Flèch blan yo endike pwen ThT-pozitif nan tou de panno yo.Ba echèl la pou tout imaj se 20 µm.
Pou egzamine an plis detay chanjman ki fèt nan rezo pwoteyin coacervate pandan tranzisyon soti nan likid nan solid, nou te itilize fluoresans pou tout lavi D (FLIM) ak mikwoskòp transfè enèji sonorite Förster (FRET) (Figi 6 ak Figi siplemantè 8 ak 9).Nou te ipotèz ke spirasyon coacervate nan kouch la nan yon estrikti pwoteyin ki pi kondanse oswa menm solid ki sanble mennen nan kontak pi pre ant pwoteyin nan ak pwofonde fliyoresan ki tache ak li, potansyèlman pwodui yon efè asouvisman manifeste nan yon lavi sond ki pi kout (τ) , jan sa dekri deja40.,41 ,42.Anplis de sa, pou echantiyon doub ki make (AF488 ak Atto647N kòm koloran donatè FRET ak akseptè, respektivman), diminisyon sa a nan τ kapab tou akonpaye pa kondansasyon coacervate ak yon ogmantasyon nan efikasite FRET (E) pandan LSPT.Nou te kontwole fòmasyon kannòt ak plas sou tan nan echantiyon LLPS αS/Tau441 ak αS/ΔNt-Tau (25 µM nan chak pwoteyin nan tanpon LLPS ki gen 1 µM AF488 ki make αS ak/oswa Atto647N ki make Tau441 oswa ΔNt-Tau).Nou te obsève yon tandans jeneral nan ki dire lavi fliyoresan nan AF488 (τ488) ak Atto647N (τ647N) sond yo diminye yon ti kras kòm coacervats yo gen matirite (Figi 6 ak Figi Siplemantè 8c).Enteresan, chanjman sa a te siyifikativman amelyore pou pwen nan kannòt (Fig. 6c), ki endike ke plis kondansasyon pwoteyin ki te fèt nan pwen.Nan sipò sa a, pa gen okenn chanjman enpòtan nan lavi fluoresans yo te obsève pou ti gout αS / ΔNt-Tau ki gen laj pou 24 èdtan (Siplemantè Fig. 8d), sijere ke jelasyon ti gout se yon pwosesis ki diferan de tach epi ki pa akonpaye pa siyifikatif reòganizasyon molekilè. nan coacervates.Li ta dwe remake ke pwen yo gen diferan gwosè ak kontni varyab nan αS, espesyalman pou sistèm nan αS / Tau441 (figi siplemantè 8e).Diminisyon nan lavi fluoresans tach la te akonpaye pa yon ogmantasyon nan entansite, espesyalman pou Atto647N ki make Tau441 (Siplemantè Fig. 8a), ak pi wo efikasite FRET pou tou de αS/Tau441 ak αS/ΔNt-Tau sistèm, ki endike plis kondansasyon nan LLPS Senk èdtan. apre deklanche, pwoteyin yo andedan elektrisite estatik la kondanse.Konpare ak αS/ΔNt-Tau, nou te obsève pi ba τ647N ak yon ti jan pi wo valè τ488 nan tach αS/Tau441, akonpaye pa pi ba ak plis inomojèn valè FRET.Li posib, sa a ka gen rapò ak lefèt ke nan sistèm αS / Tau441, abondans αS obsève ak espere nan total se pi eterojèn, souvan substoichiometric konpare ak Tau, depi Tau441 tèt li ka tou sibi LLPS ak agrégation (Siplemantè Fig. 8e) .Sepandan, degre nan koalsans ti gout, fòmasyon kannòt, ak, sa ki enpòtan, agrégation pwoteyin nan likid ki tankou coacervates se maksimòm lè tou de Tau441 ak αS yo prezan.
yon mikwoskopi fluoresans pou tout lavi (FLIM) imaj αS/Tau441 ak αS/ΔNt-Tau nan 25 μM nan chak pwoteyin (1 μM AF488 ki make αS ak 1 μM Atto647N ki make Tau441 oswa ΔNt-Tau tanpon).Kolòn yo montre imaj reprezantatif echantiyon LLPS nan diferan moman spirasyon (30 min, 5 è ak 24 èdtan).Ankadreman wouj la montre rejyon an ki genyen tach αS/Tau441.Dire lavi yo montre kòm ba koulè.Ba echèl = 20 µm pou tout imaj.b Imaj FLIM agrandi zòn chwazi a, ki montre nan bwat wouj ki nan panèl a.Ranje lavi yo montre lè l sèvi avèk menm echèl koulè ak nan panèl a.Ba echèl = 5 µm.c Istogram ki montre AF488 (tache ak αS) oswa Atto647N (tache ak Tau) pou diferan espès pwoteyin (ti gout-D-, kannòt-R- ak speckle-P) idantifye nan imaj FLIM ki anrejistre pou αS-) distribisyon distribisyon tan lavi Tau441 ak αS/ΔNt-Tau echantiyon coacervate (N = 17-32 ROI pou D, 29-44 ROI pou R, ak 21-51 ROI pou pwen).Valè mwayen ak medyàn yo montre kòm kare jòn ak liy nwa andedan bwat yo, respektivman.Fwontyè ki pi ba ak anwo yo nan bwat la reprezante premye ak twazyèm katil yo, respektivman, ak valè minimòm ak maksimòm ki nan seri entèrquartile 1.5-fold (IQR) yo montre kòm moustach.Outliers yo montre kòm Diamonds nwa.Siyifikasyon estatistik ant pè distribisyon yo te detèmine lè l sèvi avèk yon tès t de echantiyon, sipoze divèjans inegal.Tès-p-valè yo montre ak asterisk pou chak pè done konpare (* p-valè > 0.01, ** p-valè > 0.001, *** p-valè > 0.0001, **** p-valè > 0.00001), ns Endike neglijibilite (p-valè > 0.05).Valè p egzak yo bay nan Tablo Siplemantè 1, epi done orijinal yo prezante kòm dosye done anvan tout koreksyon.
Pou plis demontre nati amyloid-tankou nan speckles / total, nou trete echantiyon coacervate san tach pou 24 èdtan ak gwo konsantrasyon nan (1 M) NaCl, ki te lakòz separasyon nan total de coacervates pwoteyin.Lè yo te obsève granul izole (sa vle di, yon solisyon dispèse nan granul) lè l sèvi avèk mikwoskòp fòs atomik (AFM), nou te obsève yon mòfoloji majorite esferik ak yon wotè regilye apeprè 15 nm, ki gen tandans asosye nan kondisyon ki gen gwo konsantrasyon sèl, menm jan ak konpòtman an nan fibril amiloid tipik akòz efè a fò idrofob sou sifas la (remake ke fibrils tipikman gen yon wotè nan ~ 10 nm) (Siplemantè Fig. 10a).Enteresan, lè total izole yo te enkube ak ThT nan yon tès fluoresans ThT estanda, nou obsève yon ogmantasyon dramatik nan pwodiksyon pwopòsyon fluoresans ThT, ki konparab ak sa yo obsève lè yo te enkubasyon lank ak tipik αS amyloid fibrils (figi siplemantè 10b), sijere ke total coacervate yo gen estrikti ki sanble ak amiloid..An reyalite, total yo te toleran gwo konsantrasyon sèl men sansib a 4 M guanidine klori (GdnHCl), tankou fibrils amiloid tipik (figi siplemantè 10c).
Apre sa, nou analize konpozisyon total yo lè l sèvi avèk yon sèl fliyoresans molekil, espesifik korelasyon fluoresans / kwa-korelasyon spèktroskopi (FCS / FCCS), ak analiz pete nan deteksyon konyensidans de koulè (TCCD).Pou sa ka fèt, nou izole total ki te fòme apre 24 èdtan nan enkubasyon nan 100 μl echantiyon LLPS ki gen αS ak Tau441 (tou de 25 μM) ansanm ak 1 μM AF488 ki make αS ak 1 μM Atto647N ki make Tau441.Delye solisyon total dispersés ki kapab lakòz nan yon eta monomolekilè lè l sèvi avèk menm tanpon PEG-gratis la ak 1 M NaCl (menm tanpon ki itilize pou separe total ak coacervate) pou anpeche nenpòt entèraksyon elektwostatik posib ant LLPS ak pwoteyin.Yon egzanp sou trajectoire tan yon sèl molekil ka wè nan Fig. 7a.Analiz FCCS/FCS (kwa-korelasyon, CC ak otokorelasyon, AC) te montre ke granul ki gen αS ak tau te abondan nan echantiyon yo (gade koub CC nan Fig. 7b, panèl gòch), ak yon eksè nan pwoteyin rezidyèl monomerik leve kòm yon rezilta nan pwosesis la dilution (gade koub AC nan Figi 7b, panèl gòch).Eksperyans kontwòl ki fèt nan menm kondisyon solisyon yo lè l sèvi avèk echantiyon ki genyen sèlman pwoteyin monomerik pa te montre pa gen okenn koub CC, ak koub AC yo anfòm byen ak modèl difizyon yon sèl-konpozan (Ek. 4), kote pwoteyin monomerik gen koyefisyan difizyon espere (Fig. 7b). ), panèl dwat).Koyefisyan difizyon nan patikil total se mwens pase 1 µm2 / s, ak sa ki nan pwoteyin monomerik se apeprè 1 µm2 / s.50-100 µm/s;valè yo sanble ak valè ki te pibliye deja pou fibril amiloid αS ak monomerik αS separeman nan kondisyon solisyon menm jan an44.Lè nou analize total yo ak analiz eksplozyon TCCD (figi 7c, panèl tèt), nou te jwenn ke nan chak total izole (αS/Tau heteroaggregate), apeprè 60% nan total detekte yo genyen tou de αS ak tau, apeprè 30% genyen sèlman. tau, apeprè 10% αS sèlman.Analiz esteyyometrik αS/Tau heteroaggregates te montre ke pi fò nan heteroaggregate yo te rich nan tau (estokiometri anba a 0.5, kantite mwayèn tau molekil pou chak total se 4 fwa plis pase molekil αS), ki konsistan avèk travay nou obsève nan FLIM in situ. eksperyans..Analiz FRET te montre ke total sa yo te genyen tou de pwoteyin, byenke valè aktyèl FRET yo nan ka sa a pa gen anpil enpòtans, paske distribisyon fliyofò nan chak total te o aza akòz yon eksè pwoteyin san etikèt ki te itilize nan eksperyans la.Enteresan, lè nou te fè menm analiz la lè l sèvi avèk 45,46 matirite amiloid agrégation-defisi Tau Variant (gade Fig. Siplemantè 11a, b), nou remake ke byenke agrégasyon elektwostatik αS la te menm bagay la (Fig. Siplemantè 11c, d), kapasite pou fòme total nan coacervate a te redwi drastikman ak FLIM te detekte plizyè tach nan eksperyans nan situ, epi yo te obsève koub kwa-korelasyon fèb pou echantiyon total izole.Sepandan, pou yon ti kantite total detekte (sèlman yon dizyèm nan Tau441), nou obsève ke chak total te rich nan αS pase sa a Variant Tau, ak apeprè 50% nan total yo detekte ki gen sèlman molekil αS, ak αS te eterojèn nan depase. .total (gade Figi Siplemantè 11e), kontrèman ak total etewojèn ki te pwodwi pa Tau441 (Fig. 6f).Rezilta yo nan eksperyans sa yo te montre ke byenke αS tèt li se kapab akimile ak tau nan coacervate la, tau nucleation se pi favorab nan kondisyon sa yo, ak rezilta yo ki sanble amiloid yo kapab aji kòm yon fòm nan αS ak tau.Sepandan, yon fwa yo fòme yon nwayo tau ki rich, entèraksyon eterotip ant αS ak tau yo favorize nan total sou entèraksyon omotip ant molekil tau;nou tou obsève rezo pwoteyin nan likid αS/tau coacervates.
a Reprezantan tras tanporèl fluoresans nan molekil sèl nan total izole ki te fòme nan αS/Tau441 koacervat elektwostatik.Eklatman ki koresponn ak coaggregates αS/Tau441 (eksplozyon pi wo pase papòt endike a) yo te obsève nan twa chanèl deteksyon (AF488 ak Atto647N emisyon apre eksitasyon dirèk, liy ble ak wouj, emisyon Atto647N apre eksitasyon endirèk), FRET, liy vyolèt).b FCS/FCCS analiz de yon echantiyon αS/Tau441 total izole yo jwenn nan LLPS (panèl gòch).Koub Autokorelasyon (AC) pou AF488 ak Atto647N yo montre an ble ak wouj, respektivman, ak koub kwa-korelasyon (CC) ki asosye ak total ki gen tou de koloran yo montre an koulè wouj violèt.Koub AC yo reflete prezans espès pwoteyin monomerik ak totalize ki make, pandan y ap koub CC yo montre sèlman difizyon total ki make doub.Menm analiz la, men nan kondisyon solisyon yo menm jan ak nan tach izole, echantiyon ki gen sèlman monomerik αS ak Tau441 yo montre kòm kontwòl nan panèl dwat la.c Fliyoresan analiz flash nan molekil sèl nan total izole ki te fòme nan αS/Tau441 coacervates elektwostatik.Enfòmasyon pou chak total yo jwenn nan kat repetisyon diferan (N = 152) yo trase kont esteyometri yo, valè S yo, ak efikasite FRET (panèl anlè, ba koulè reflete ensidans).Twa kalite total yo ka distenge: -αS-sèlman total ki gen S~1 ak FRET~0, Tau-sèlman total ki gen S~0 ak FRET~1, ak total etewojèn Tau/αS ak entèmedyè S ak FRET Estimasyon kantite lajan an. nan tou de pwoteyin makè yo detekte nan chak total etewojèn (N = 100) yo montre nan panèl ki pi ba a (echèl koulè a ​​reflete ensidan an).Done kri yo bay sou fòm dosye done kri.
Matirite oswa aje nan kondansasyon pwoteyin likid nan estrikti ki sanble ak jèl oswa solid sou tan yo te rapòte yo dwe patisipe nan plizyè fonksyon fizyolojik nan kondansasyon an47 osi byen ke nan maladi, kòm yon pwosesis nòmal anvan agrégation amiloid 7, 48, 49. Isit la. nou etidye faz separasyon ak konpòtman an detay.LSPT αS nan prezans polycations o aza nan yon anviwònman kontwole nan konsantrasyon mikromolar ki ba ak kondisyon fizyolojik ki enpòtan (remake ke konsantrasyon nan kalkile fizyolojik nan αS se > 1 µM50), apre konpòtman tipik tèmodinamik kondwi nan LPS.Nou te jwenn ke αS, ki gen yon rejyon C-tèminal trè negatif chaje nan pH fizyolojik, se kapab fòme ti gout ki rich nan pwoteyin nan solisyon akeuz atravè LLPS nan prezans peptides trè kationik dezòd tankou pLK oswa Tau atravè pwosesis la nan elektwostatik. kondansasyon konplèks nan prezans macromolecules agrégation.Pwosesis sa a ka gen efè enpòtan nan anviwònman selilè kote αS rankontre divès molekil polycationic ki asosye ak agrégation maladi li yo tou de nan vitro ak nan vivo51,52,53,54.
Nan anpil etid, yo te konsidere dinamik pwoteyin nan ti gout kòm youn nan faktè kle ki detèmine pwosesis spirasyon an55,56.Nan elektwostatik αS coacervates ak polycations, pwosesis spirasyon an aparamman depann sou fòs nan entèraksyon ak polycations, valans la, ak miltiplisite nan entèraksyon sa yo.Teyori ekilib sijere ke yon peyizaj ekilib nan de eta likid ta dwe prezans nan yon gwo ti gout ki rich nan biopolymers ki kondwi LLPS57,58.Kwasans ti gout ka reyalize pa spirasyon Ostwald59, coalescence60 oswa konsomasyon monomère gratis nan faz dispèse61.Pou αS ak Tau441, ΔNt-Tau oswa pLK, pi fò nan pwoteyin lan te konsantre nan kondansasyon an nan kondisyon yo itilize nan etid sa a.Sepandan, pandan tout gwosè tau gouttelettes fusion rapid sou sifas mouillage, gouttelettes coalescence ak mouillage te difisil pou ΔNt-Tau ak pLK, sijere yon pèt rapid nan pwopriyete likid nan de sistèm sa yo.Dapre analiz FLIM-FRET nou an, ti gout pLK ak ΔNt-Tau ki gen laj yo te montre yon degre agrégation pwoteyin ki sanble (tankou fluoresans pou tout lavi) ak ti gout orijinal yo, ki sijere ke rezo pwoteyin orijinal la te kenbe, byenke plis rijid.
Nou rasyonèl rezilta eksperimantal nou yo nan modèl sa a (Figi 8).Okòmansman tanporèman fòme ti gout yo souvan rezo pwoteyin san konpansasyon elektwostatik, e konsa gen zòn nan dezekilib chaj, espesyalman nan koòdone nan ti gout, sa ki lakòz ti gout ak yon gwo potansyèl sifas elektwostatik.Pou konpanse pou chaj (yon fenomèn souvan refere yo kòm rediksyon valans) epi minimize potansyèl sifas ti gout yo, ti gout yo ka gen ladan nouvo polipeptid ki soti nan faz dilye, reòganize rezo pwoteyin pou optimize entèraksyon chaj-chaj, epi kominike avèk lòt ti gout.ak sifas (mouillage).Ti gout αS/pLK yo, akòz rezo pwoteyin ki pi senp yo (sèlman entèraksyon eterotip ant αS ak pLK) ak pi gwo afinite pou entèraksyon pwoteyin-pwoteyin, sanble yo kapab balanse chaj la nan kondansasyon an pi vit;vre, nou te obsève pi vit sinetik pwoteyin nan okòmansman fòme αS/pLK coacervates pase nan αS/Tau.Apre rediksyon valans, entèraksyon yo vin mwens efemèr ak ti gout yo pèdi pwopriyete likid yo epi yo vire nan ti gout jèl ki pa ka pran dife ak yon potansyèl sifas elektwostatik ki ba (ak Se poutèt sa pa kapab mouye sifas la).Kontrèman, ti gout αS / Tau yo mwens efikas nan optimize balans chaj gout akòz rezo pwoteyin pi konplèks (ak tou de entèraksyon omotipik ak eterotip) ak nati a pi fèb nan entèraksyon pwoteyin.Sa a rezilta nan ti gout ki kenbe konpòtman likid pou peryòd tan ki pwolonje epi montre yon gwo potansyèl sifas elektwostatik ki gen tandans pou minimize pa coalescing ak ap grandi (kidonk minimize rapò sifas / volim nan ti gout yo) ak pa mouye chem nan sifas idrofil.Sa a kreye gwo bibliyotèk pwoteyin konsantre ki kenbe pwopriyete likid kòm entèraksyon yo rete trè pasajè akòz rechèch la konstan pou optimize chaj nan rezo pwoteyin lan.Enteresan, fòm N-tèminal tronke nan Tau, ki gen ladan kèk izoform natirèl62, montre konpòtman entèmedyè, ak kèk coacervates aje ak αS nan ti gout jèl ki dire lontan, pandan ke lòt moun transfòme nan kondansasyon likid gwo.Duality sa a nan spirasyon αS elèktrostatik coacervates ki konsistan avèk dènye etid LLPS teyorik ak eksperimantal ki te idantifye yon korelasyon ant rediksyon valans ak tami elektwostatik nan kondansasyon kòm yon kle nan kontwole gwosè kondansasyon ak pwopriyete likid.Mekanis 58.61.
Konplo sa a montre wout agrégation amiloid sitatif pou αS ak Tau441 atravè LLPS ak LSPT.Avèk rejyon adisyonèl ki rich anyon (wouj) ak kasyon ki rich (ble), αS ak tau elektwostatik coacervates ak valans satisfezan gen pi ba enèji sifas ak Se poutèt sa mwens coalescence, sa ki lakòz aje rapid ti gout.Yon eta ki estab jèl ki pa agglomerated reyalize..Sitiyasyon sa a trè favorab nan ka sistèm αS/pLK la akòz pi wo afinite li yo ak pi senp rezo entèraksyon pwoteyin-pè, ki pèmèt pou yon tranzisyon vit ki tankou jèl.Okontrè, ti gout ak valans ki pa satisfezan ak, kidonk, rejyon ki chaje ak pwoteyin ki disponib pou entèraksyon, fè li pi fasil pou coacervate a fusion ak mouye sifas idrofil yo nan lòd yo diminye enèji sifas segondè li yo.Sitiyasyon sa a pi bon pou coacervates αS/Tau441, ki gen yon rezo konplèks miltivalan ki fòme ak entèraksyon fèb Tau-Tau ak αS-Tau.Nan vire, pi gwo coacervats pral pi fasil kenbe pwopriyete likid yo, sa ki pèmèt lòt entèraksyon pwoteyin-a-pwoteyin rive.Evantyèlman, total amiloid eterojèn ki gen tou de fòm αS ak tau nan likid coacervate a, ki ka gen rapò ak sa yo jwenn nan kò enklizyon, ki se karakteristik maladi neurodegenerative.
Gwo estrikti ki sanble ak likid ki fòme pandan spirasyon αS/Tau441 ak yon anviwònman pwoteyin trè konjesyone men dinamik, epi, nan yon pi piti, coacervates αS/ΔNt-Tau yo se rezèvwa ideyal pou nikleyasyon agrégation pwoteyin.Nou te tout bon obsève fòmasyon nan total pwoteyin solid nan kalite sa a nan coacervates pwoteyin, souvan ki gen tou de αS ak tau.Nou te montre ke heteroaggregate sa yo estabilize pa entèraksyon ki pa elektwostatik, yo kapab mare koloran ThT espesifik amiloid nan menm fason an kòm fibr amiloid tipik, epi tout bon gen rezistans menm jan ak enfliyans divès kalite.Yo montre total αS/tau ki te fòme pa LLPS yo gen pwopriyete ki sanble ak amiloid.Vreman vre, varyant ki gen matirite nan Tau ensufizant nan agrégation amiloid se siyifikativman gen pwoblèm nan fòmasyon nan sa yo αS total heterogeneous nan likid elèktrostatik coacervate la.Fòmasyon αS/Tau441 granules te obsève sèlman anndan coacervates yo, ki te kenbe likid ki tankou pwopwiyete, e pa janm, si coacervats/gouttes yo pa t ' rive nan eta gel.Nan dènye ka a, fòs la ogmante nan entèraksyon elektwostatik ak, kòm yon rezilta, frigidité nan rezo a pwoteyin anpeche rearanjman konformasyon ki nesesè nan pwoteyin yo etabli nouvo entèraksyon pwoteyin ki nesesè pou nukleasyon amiloid.Sepandan, sa ka reyalize nan pi fleksib, likid ki tankou coacervats, ki an vire gen plis chans yo rete likid kòm yo ogmante nan gwosè.
Lefèt ke fòmasyon nan granules nan faz kondansasyon an pi preferab nan gwo kondansasyon αS/Tau pase nan ti gout ki rapidman jele, mete aksan sou enpòtans pou idantifye faktè ki kontwole koalesans gout.Kidonk, pa sèlman gen yon tandans pou separasyon faz, men gwosè kondansasyon an dwe kontwole pou bon fonksyone osi byen ke prevansyon maladi58,61.Rezilta nou yo tou mete aksan sou enpòtans ki genyen nan balans ki genyen ant LLPS ak LSPT pou sistèm αS/Tau.Pandan ke fòmasyon ti gout ka pwoteje kont agrégation amiloid pa diminye kantite monomè pwoteyin ki disponib nan kondisyon saturation, jan sa te pwopoze nan lòt sistèm63,64, fizyon ti gout nan nivo ti gout segondè ka mennen nan agrégation pwoteyin entèn nan ralanti rearanjman konformasyon.rezo pwoteyin..
An jeneral, done nou yo fòtman mete aksan sou enpòtans valans limenm ak entèraksyon satisfè/satisfè nan rezo gout nan kontèks LSPT.An patikilye, nou montre ke kondansasyon αS/Tau441 tout longè yo kapab fusion ak nwayo avèk efikasite pou fòme heteroagregate amiloid ki gen ladan tou de pwoteyin epi pwopoze yon mekanis molekilè ki baze sou rezilta eksperimantal nou an.Ko-agregasyon de pwoteyin nan coacervate likid αS/Tau ke nou rapòte isit la ka gen rapò ak ko-lokalizasyon de pwoteyin nan enklizyon, ki se karakteristik maladi a, epi li ka kontribye nan konprann relasyon ki genyen ant LLPS ak agrégation amiloid, pave wout la pou IDP trè chaje nan neurodegeneration.
Monomeric WT-αS, mutan cysteine ​​(Q24C-αS, N122C-αS) ak ΔCt-αS variants (Δ101-140) yo te eksprime nan E. coli ak pirifye jan sa dekri deja.5 mM DTT te enkli nan tout etap nan pirifikasyon mutan sistein αS pou anpeche fòmasyon kosyon disulfid.Tau441 izoform (plasmid ki te jwenn nan Addgene #16316), ΔNt-Tau variant (Δ1–150, ki te jwenn pa klonaj IVA ak primè CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTCTTCTTAAAGTTAAAC) ak AggDef-Tau varyant ki te pirifye-kilti (G31TC, G31TC, coli primè) yo te pirifye (G31TC, 7 primè). grandi nan OD600 = 0.6-0.7 nan 37 ° C ak 180 rpm, ak ekspresyon te pwovoke ak IPTG pou 3 èdtan nan 37 ° C.Rekòlte selil yo nan 11,500 xg pou 15 min nan 4 °C epi lave yo ak tanpon saline ki gen 150 mM NaCl.Resuspend granules a nan tanpon lysis (20 ml pou chak 1 L LB: MES 20 mM, pH 6.8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0.2 mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, benzamidine 50 μM, copeptin μM100).Etap sonication la te fèt sou glas ak yon anplitid 80% pou 10 pulsasyon (1 min sou, 1 min koupe).Pa depase 60 ml nan yon sèl ultrason.E. coli lysates yo te chofe nan 95 ° C pou 20 minit, Lè sa a, refwadi sou glas ak santrifuje nan 127,000 × g pou 40 minit.Sipènatant klarifye a te aplike nan yon manbràn 3.5 kDa (Spectrum™ Thermo Fisher Scientific, UK) epi dyalize kont 4 L tanpon dyaliz (20 mM MES, pH 6.8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT 2 mM). , PMSF 0.1 mM) pou 10 èdtan.Yon kolòn echanj kasyon 5 ml (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, USA) te ekilibre ak tanpon ekilib (20 mM MES, pH 6.8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 mM PMSF).Lisat tau a te filtre nan yon filtè PVDF 0.22 μm ak sou fòm piki nan kolòn nan yon pousantaj koule nan 1 ml / min.Elisyon te pote soti piti piti, tau te eliye ak 15-30% tanpon elisyon (20 mM MES, pH 6.8, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 mM PMSF).Fraksyon yo te analize pa SDS-PAGE, ak nenpòt fraksyon ki gen yon gwoup ak pwa molekilè espere nan tau yo te konsantre lè l sèvi avèk yon filtè santrifijeur 10 kDa epi ranplase ak yon tanpon ki gen 10 mM HEPES, pH 7.4, NaCl 500 mM ak DTT 2 mM pou konsantrasyon nan pwoteyin final la te 100 μM.Lè sa a, solisyon an pwoteyin te pase nan yon filtè PVDF 0.22 μm, byen vit nan frizè epi estoke nan -80 ° C.Pwoteyin K18 te byen bay pwofesè Alberto Boffi.Pite preparasyon an te > 95% jan SDS-PAGE ak MALDI-TOF/TOF konfime.Divès sistein yo te make chimikman ak AlexaFluor488-maleimid (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) oswa TEMPOL-maleimide (Toronto Research Chemicals, Toronto, Kanada).yo te konfime pa absòbe ak MALDI-TOF/TOF.Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau ak K18 te make ak rezidi sistein natif natal nan pozisyon 191 ak 322 lè l sèvi avèk Atto647N-maleimide (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Almay) swiv menm pwosedi a.Chaj nèt pou chak kat rezidi pou αS ak Tau441 yo te pwodwi lè l sèvi avèk CIDER66.
Solid poly-L-lysine (pLK DP 90-110 dapre NMR ki soti nan founisè, Alamanda Polymers Inc, Huntsville, Alabama, USA) te fonn nan 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7.4 a 10 mM konsantrasyon, pwosesis sonicated pou 5 minit nan yon beny dlo ultrasons epi estoke nan -20 ° C.PEG-8, dextran-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, USA) ak FITC-dextran-500 (Sigma -Aldrich, Sant Louis, MI, USA) yo idrosolubl ak lajman distribiye nan tanpon LLPS.Dyaliz retire sèl ki kontamine.Lè sa a, yo te filtre nan yon filtè sereng ak yon gwosè pò a 0.22 μm, epi konsantrasyon yo te kalkile lè l sèvi avèk yon refractometer (Mettler Toledo, Columbus, Ohio, USA).Echantiyon LLPS yo te prepare nan tanperati chanm nan lòd sa a: tanpon ak extrusion yo te melanje ak 1 mM tris (2-carboxyethyl) fosfin (TCEP, Carbosynth, Compton, UK), 1 mM 2,2,2,2-(Ethane-). 1, 2-diyldinitrile) asid tetraacetic (EDTA, carboxynth) ak yon melanj de 1% inibitè proteaz (PMSF 100 mM, benzimide 1 mM, leupeptin 5 μM).Lè sa a, αS ak polycations fusion (opsyon pLK oswa Tau) yo ajoute.Pou eksperyans thioflavin-T seri tan (ThT, Carbosynth, Compton, UK), sèvi ak konsantrasyon total ThT pou mwatye konsantrasyon αS la.Dousman men byen melanje echantiyon yo pou asire yo omojèn.Konsantrasyon an nan chak eleman varye soti nan eksperyans nan eksperyans, jan sa dekri nan seksyon an Rezilta.Yo te itilize azid nan yon konsantrasyon 0.02% (w/v) chak fwa dire eksperyans lan depase 4 èdtan.Pou tout analiz ki sèvi ak echantiyon LLPS, pèmèt melanj lan ekilibre pou 5 minit anvan analiz la.Pou analiz limyè gaye, yo te chaje 150 µl echantiyon yo sou mikroplak 96-pou ki pa obligatwa (µClear®, nwa, F-Bottom/Chimney Well, Greiner bio-one, Kremsmünster, Otrich) epi kouvri ak fim adezif.LLP yo te kontwole lè yo mezire absorpsyon nan 350 nm nan sant solisyon an nan yon lektè plak CLARIOstar (BMG Labtech, Ortenberg, Almay).Eksperyans yo te fèt an triple nan 25 ° C, ak erè yo te kalkile kòm devyasyon estanda a nan mwayèn nan.Faz dilye a te quantifye pa echantiyon santrifijasyon ak analiz jèl SDS-PAGE, ak fraksyon αS nan faz dilye ak konsantre yo te quantifye nan divès solisyon LLPS.Yon echantiyon 100 μl LLPS ki gen 1 μM AF488 ki make αS te prepare pa bon jan melanje ki te swiv pa santrifujasyon nan 9600 × g pou 30 minit, apre sa presipite a te anjeneral vizib.Yo te itilize tèt 50 μl supernatant la pou quantification pwoteyin lè l sèvi avèk jèl SDS-PAGE.Jèl yo te analize ak filtè AF488 lè l sèvi avèk yon sistèm D jèl ChemiDoc (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) oswa tache ak tach Coomassie epi yo te vizyalize ak filtè ki apwopriye yo.Gwoup ki lakòz yo te analize lè l sèvi avèk ImageJ vèsyon 1.53i (National Institutes of Health, USA).Eksperyans yo te fèt an kopi nan de eksperyans diferan ak rezilta menm jan an.
Tipikman, 150 μl nan echantiyon yo te aplike nan mikroplak ki pa obligatwa 96-byen ak visualized nan tanperati chanm sou yon mikwoskòp Leica DMI6000B Envèse (Leica Microsystems, Wetzlar, Almay).Pou eksperyans tach, yo te itilize plak µ-Slide Angiogenesis (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Almay) oswa 96-well polystyrène mikroplak (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts).EL6000 alojene oswa mèki metal halogen lanp yo te itilize kòm sous ekleraj (pou BF / DIC ak WF D, respektivman).Pou mikwoskopi WF, yo te itilize yon objektif lè agrandisman 40x (Leica Microsystems, Almay) pou konsantre limyè a sou echantiyon an epi kolekte li.Pou echantiyon ki make AF488 ak ThT, eksitasyon filtre ak emisyon ak seri filtre GFP estanda, eksitasyon ak filtè bandpass emisyon, respektivman, 460-500 nm ak 512-542 nm filtè bandpass, ak yon glas dichroic 495 nm.Pou echantiyon ki make ak Atto647N, yo te itilize yon seri estanda filtè Cy5 ak eksitasyon ak filtè bandpass emisyon 628-40 nm ak 692-40 nm, respektivman, ak yon glas dichroic 660 nm.Pou mikwoskopi BF ak DIC, sèvi ak menm objektif koleksyon limyè reflete.Limyè a kolekte te anrejistre sou yon kamera Leica DFC7000 CCD (Leica Microsystems, Almay).Tan ekspoze a te 50 ms pou imaj mikwoskòp BF ak DIC ak 20-100 ms pou imaj mikwoskòp WF.Pou konparezon, tan an ekspoze pou tout eksperyans ak ThT te 100 ms.Eksperyans time-lapse yo te fèt pou vizyalize koalesans ti gout, ak imaj yo te kolekte chak 100 ms pandan plizyè minit.ImageJ (NIH, USA) te itilize pou analiz imaj.Eksperyans yo te fèt an triple ak rezilta menm jan an.
Pou eksperyans kolokizasyon, FRAP ak rekonstriksyon 3D, imaj yo te akeri sou yon mikwoskòp konfokal envèse Zeiss LSM 880 lè l sèvi avèk yon edisyon ZEN 2 ble (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Almay).Echantiyon 50 µl yo te aplike nan asyèt µ-Slide Angiogenesis Petri (Ibidi GmbH, Gröfelfing, Almay), trete ak yon polymère idrofil (ibiTreat) epi monte nan yon objektif imèsyon lwil oliv 63 × (Plan-Apochromat 63 × / NA 1.4 lwil oliv) sou DIC).Imaj yo te akeri lè l sèvi avèk 458 nm, 488 nm, ak 633 nm liy lazè agon ak yon rezolisyon 0.26 µm / piksèl ak yon tan ekspoze nan 8 µs / piksèl pou eksitasyon ak fenèt deteksyon emisyon nan 470-600 nm, 493-628 nm, ak 638-755 nm te itilize pou visualiser ThT, AF488 ak Atto647N, respektivman.Pou eksperyans FRAP yo, yo te anrejistre fotografi tan-la nan chak echantiyon nan 1 ankadreman pou chak segonn.Eksperyans yo te fèt an triple nan tanperati chanm ak rezilta menm jan an.Tout imaj yo te analize lè l sèvi avèk Zen 2 lojisyèl edisyon ble (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Almay).Koub FRAP yo te nòmalize, trase ak ekipe nan done entansite/tan ki sòti nan imaj lè l sèvi avèk Zen 2 lè l sèvi avèk OriginPro 9.1.Koub rekiperasyon yo te ekipe nan yon modèl mono-eksponansyèl pou kont pou difizyon molekilè ak yon tèm eksponansyèl adisyonèl pou kont pou efè a blanchi akizisyon.Lè sa a, nou kalkile D lè l sèvi avèk reyon klowòks nominal la ak mwatye lavi a rekiperasyon te detèmine deja tankou nan ekwasyon an nan Kang et al.5 35 yo montre.
Selibatè cysteine ​​αS te sentèz ak 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPOL) nan pozisyon 24 (TEMPOL-24-αS) ak 122 (TEMPOL-122-αS), respektivman.Spin Labeling Pou eksperyans EPR, konsantrasyon αS te fikse nan 100 μM ak konsantrasyon PEG te 15% (w/v).Pou kondisyon agrégasyon divès kalite, rapò αS:pLK te 1:10, pandan y ap αS:ΔNt-Tau ak αS:Tau441 rapò yo te kenbe nan 1:1.Pou eksperyans titrasyon obligatwa nan absans foul moun, TEMPOL-122-αS te kenbe nan 50 μM ak polycations yo te titrate nan ogmante konsantrasyon, prepare chak kondisyon separeman.Mezi CW-EPR yo te pote soti lè l sèvi avèk yon espektwomèt Bruker ELEXSYS E580 X-band ekipe ak yon resonator Bruker ER4118 SPT-N1 opere nan yon frekans mikwo ond (SHF) nan ~ 9.7 GHz.Tanperati a te fikse nan 25 ° C ak kontwole pa yon kriostat nitwojèn likid.Spectre yo te jwenn nan kondisyon enstore nan yon pouvwa MW nan 4 mW, yon anplitid modulation nan 0.1 mT, ak yon frekans modulation nan 100 kHz.Entansite espèk yo te nòmalize pou evite diferans ki genyen nan konsantrasyon vire ant echantiyon yo ak posib rediksyon vire akòz konsantrasyon rezidyèl nan ajan rediksyon nan echantiyon ki gen Tau441 oswa ΔNt-Tau (prezan nan solisyon pwoteyin orijinal yo).Valè yo bay nan g yo te jwenn kòm yon rezilta nan EPR modèl espèk fèt lè l sèvi avèk lojisyèl Easyspin (v. 6.0.0-dev.34) aplike nan Matlab®67.Yo te itilize modèl izotwòp youn/de eleman pou modèl done yo.Apre yo fin nòmalize tout siyal yo, yo te kalkile rezidyèl yo lè yo retire chak simulation nan spectre eksperimantal ki koresponn lan.Pou analiz titrasyon obligatwa, yo te itilize entansite relatif twazyèm gwoup la nan dezyèm gwoup la nan spectre EPR nòmalize (IIII/III) pou kontwole obligatwa polycations nan αS.Pou estime konstan disosyasyon an (Kd), yo te ekipe koub la ki kapab lakòz nan yon modèl apwoksimatif sipoze n sit obligatwa ki idantik ak endepandan.
Eksperyans spèktroskopi NMR yo te pote soti lè l sèvi avèk yon espektwomèt NMR Bruker Neo 800 MHz (1H) ekipe ak yon kriyosond ak Z-gradyan.Tout eksperyans yo te fèt lè l sèvi avèk 130-207 µM αS ak ekivalan αS/ΔNt-Tau ak pLK ki koresponn nan 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10% DO, pH 7.4 epi yo te fèt nan 15 ° C.Pou kontwole LPS pa NMR, yo te ajoute 10% PEG nan echantiyon pre-melanje yo.Konplo perturbasyon chanjman chimik la (figi 1b) montre chanjman chimik mwayèn 1H ak 15N.Yo te bay espèk αS 2D1H-15N HSQC yo baze sou yon devwa anvan (BMRB antre #25227) epi konfime pa anrejistreman ak analize espèk 3D HNCA, HNCO ak CBCAcoNH.Chanjman chimik 13Cα ak 13Cβ yo te kalkile nan prezans ΔNt-Tau oswa pLK pou mezire chanjman posib nan tandans estrikti segondè yo konpare ak chanjman chimik αS nan konfòmasyon bobin o aza pi bon kalite 68 (figi siplemantè 5c).Pousantaj R1ρ yo te mezire lè yo anrejistre eksperyans hsqctretf3gpsi (yo te jwenn nan bibliyotèk Bruker) ak reta 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400, ak 800 ms, ak fonksyon eksponansyèl yo te ajiste nan pik delè entansite diferan. fwa pou detèmine R1ρ a ak ensètitid eksperimantal li yo.
Eksperyans mikwoskòp fluoresans de-koulè ki rezoud tan yo te fèt sou yon mikwoskòp konfokal fluoresans MT200 komèsyal ki rezoud tan (PicoQuant, Bèlen, Almay) ak yon aparèy konte foton sèl ki gen rapò ak tan (TCSPC).Tèt dyòd lazè a itilize pou eksitasyon enpulsyonèl interleaved (PIE), gwo bout bwa a pase nan yon gid ond mòd sèl epi li branche sou yon pouvwa lazè 10 a 100 nW pou liy lazè 481 nm ak 637 nm mezire apre yon glas dichroic.Sa a asire yon to pi bon pou konte foton, evite efè alyas foton, photobleaching ak saturation.μ-Slide angiogenesis coverslips oswa plak (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Almay) yo te mete dirèkteman nan dlo imèsyon sou yon lantiy Super Apochromat 60x NA 1.2 ak yon kolye korektif (Olympus Life Sciences, Waltham, USA).Yon glas dichroic 488/640 nm (Semrock, Lake Forest, IL, USA) te itilize kòm splitter gwo bout bwa prensipal la.Radyasyon san konsantre bloke pa yon twou ak yon dyamèt 50 mikron, Lè sa a, radyasyon an konsantre divize an 2 chemen deteksyon pa yon splitter gwo bout bwa 50/50.Filtè emisyon Bandpass (Semrock, Lake Forest, IL, USA) 520/35 pou lank vèt (AF488) ak 690/70 pou lank wouj (Atto647N) yo te itilize devan detektè a.Dyòd lavalas sèl-foton (SPAD) (Micro Photon Devices, Bolzano, Itali) yo te itilize kòm detektè.Tou de koleksyon done ak analiz yo te fèt lè l sèvi avèk lojisyèl SymphoTime64 ki disponib nan komès (PicoQuant GmbH, Bèlen, Almay).
Yo te aplike senkant mikrolit echantiyon LLPS nan μ-Slide pwi anjyogenesis (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Almay).Imaj ki kapab lakòz yo konsantre a 20 µm pi wo a pi wo a pou yon distans pi bon objektif travay pou ti gout sispann ak ~ 1 µm pou kannòt ak pwen ak yon rezolisyon axial omwen 0.25 µm/piksèl ak yon tan reta nan 400 µs/piksèl.Chwazi done lè w aplike yon papòt entansite ki baze sou entansite mwayèn siyal background (PBG, vle di + 2σ) pou chak kanal pou yo chwazi sèlman ti gout pwoteyin likid, kannòt, oswa tach, filtraj nenpòt orijin posib nan faz dispèse la.Pou analize lavi chak espès (τ) nan chak chanèl (vèt, "g" pou AF488 ak wouj, "r" pou Atto647N), nou chwazi rejyon enterè (ROI) ki gen ti gout, kannòt, oswa tach (Figi siplemantè 1). ).8b) ak sòti yo pa adapte pouri lavi yo (τD, τR ak τP pou ti gout, kannòt oswa tach, respektivman, gade Figi Siplemantè 8c) nan chak chanèl lè l sèvi avèk yon analiz ke-anfòm ak yon modèl dekonpozan pouri.Mwayèn τ soti nan τ .ROI ki te pwodwi twò kèk foton pou yon anfòm milti-eksponansyèl yo te eskli nan analiz la.Koupe yo itilize a se <104 foton pou kannòt ak pwen ak 103 pou gout.Ti gout yo gen yon papòt ki pi ba paske li difisil pou jwenn koub pouri anba tè ak pi gwo valè entansite, paske ti gout yo nan jaden imaj la anjeneral pi piti ak mwens anpil.ROI ak konte foton pi wo pase limit akimilasyon foton (mete nan> 500 konte / piksèl) yo te abandone tou pou analiz.Koresponn ak koub dekonpozisyon entansite yo jwenn nan rejyon enterè a ak yon entansite nan 90% nan maksimòm (yon ti kras apre entansite maksimòm dekonpozisyon an) depi nan konmansman an nan lavi sèvis la pou asire entèferans IRF minim pandan y ap kenbe menm bagay la tou pou tout pouri entansite. Anviwònman Fenèt tan relatif Yo te analize 25 a 50 ROI pou kannòt ak tach ak 15-25 ROI pou gout, imaj chwazi nan plis pase 4 kopi anrejistre nan omwen 3 eksperyans endepandan.Yo te itilize tès t de-ke pou evalye diferans estatistik ant espès oswa ant sistèm coacervate.Pou yon analiz pixel-pa-piksèl nan lavi a (τ), yo te kalkile atenuasyon total lavi a sou jaden an pou chak chanèl epi yo te fè yon apwoksimasyon nan yon modèl diminisyon eksponansyèl 2/3-konpozan.Lè sa a, diminisyon pou tout lavi a pou chak pixel te ekipe lè l sèvi avèk valè τ kalkile deja, sa ki lakòz yon imaj pseudocolor FLIM anfòm.Ranje ke-anfòm tout lavi a te menm nan tout imaj nan menm kanal la, epi chak pouri anba tè pwodui ase foton yo bay yon anfòm serye.Pou analiz FRET, piksèl yo te chwazi pa aplike yon papòt entansite pi ba nan 100 foton, ki mwayèn yon siyal background (FBG) nan 11 foton.Entansite fliyoresan chak chanèl te korije pa faktè koreksyon detèmine eksperimantal: 69 spectral crosstalk α te 0.004, eksitasyon dirèk β te 0.0305, efikasite deteksyon γ te 0.517.Lè sa a, efikasite FRET nan nivo pixel yo kalkile lè l sèvi avèk ekwasyon sa a:
kote FDD se entansite fliyoresans obsève nan kanal donatè (vèt), FDA se entansite fliyoresans obsève nan kanal la (wouj) anba eksitasyon endirèk, ak FAA se entansite fliyoresan obsève nan kanal la (wouj) anba eksitasyon dirèk ( TAT).Puls entansite fliyoresan yo obsève nan kanal la).
Mete 100 µl solisyon reyaksyon LLPS ki gen 25 µM monomerik Tau441 san etikèt (avèk oswa san 25 µM αS) nan tanpon LLPS (sipleman jan sa pi wo a) sou mikwoskòp ki pa obligatwa 96-pi ak kouch FOIL adezif ak fòmasyon ti gout yo te tcheke pa WF mikwoskòp. ekilib.nan lespas 10 min.Apre 48 èdtan nan enkubasyon nan tanperati chanm, yo te konfime prezans nan kannòt pwoteyin ak tach.Lè sa a, ak anpil atansyon retire likid la sou kannòt yo nan pwi yo, Lè sa a, ajoute 50 L nan tanpon disosyasyon (10 mM HEPES, pH 7.4, 1 M NaCl, 1 mM DTT) epi enkube pou 10 min.Konsantrasyon sèl segondè asire ke LLPS pa pral repete akòz PEG rezidyèl, epi asanble pwoteyin posib ki fòme sèlman pa entèraksyon elektwostatik yo pral demonte.Lè sa a, anba a nan pi a ak anpil atansyon grate koupe ak yon pwent mikropipèt epi yo te solisyon an ki kapab lakòz transfere nan yon obsèvasyon vid.Apre enkubasyon echantiyon yo ak 50 μM ThT pou 1 èdtan, prezans nan tach izole yo te tcheke pa mikwoskòp WF.Prepare fibril αS sonike nan enkubasyon 300 µl nan yon solisyon αS 70-µM nan PBS ak pH 7.4, azid sodyòm 0.01% nan 37 °C ak 200 rpm sou yon shaker orbital pou 7 jou.Lè sa a, solisyon an te santrifuje nan 9600 × g pou 30 min, yo te granules a resuspende nan PBS pH 7.4 ak sonished (1 min, 50% sik, 80% anplitid nan yon Vibra-Cell VC130 sonitè, Sonics, Newton, USA) echantiyon fibril. ak yon distribisyon gwosè relativman inifòm nan ti fibrils.
Analiz FCS/FCCS ak deteksyon konyensidans de koulè (TCCD) yo te fèt sou menm mikwoskòp konfokal fliyoresan MT200 ki te rezoud tan (Pico-Quant, Bèlen, Almay) yo te itilize pou eksperyans mikwoskospi FLIM-FRET lè l sèvi avèk mòd PIE la.Pouvwa lazè pou eksperyans sa yo te ajoute nan 6.0 µW (481 nm) ak 6.2 µW (637 nm).Konbinezon pouvwa lazè sa yo te chwazi pou pwodwi klète menm jan an pou pè fliyofò yo itilize pandan y ap reyalize pousantaj konte optimal epi evite photobleaching ak saturation.Tou de koleksyon done ak analiz yo te fèt lè l sèvi avèk lojisyèl SymphoTime64 vèsyon 2.3 ki disponib nan komès (PicoQuant, Bèlen, Almay).
Echantiyon αS/Tau total izole yo jwenn lè l sèvi avèk LLPS yo dilye nan tanpon izolasyon nan konsantrasyon monomolekilè ki apwopriye a (tipikman yon dilution 1:500, paske total yo deja nan konsantrasyon ba lè yo izole nan echantiyon coacervate).Echantiyon yo te aplike dirèkteman nan kouvèti kouvèti (Corning, USA) prekouch ak yon solisyon BSA nan yon konsantrasyon nan 1 mg / mL.
Pou analiz PIE-smFRET nan chanèl vèt ak wouj yo, yo te aplike yon papòt entansite ki pi ba nan 25 foton pou filtre siyal entansite ba ki te koze pa evènman monomerik (remake ke monomè yo depase echantiyon total yo konpare ak total izole).Papòt sa a te kalkile kòm senk fwa entansite mwayèn nan αS monomerik yo te jwenn nan analiz la nan echantiyon monomè pi bon kalite yo nan lòd yo espesyalman chwazi total pou analiz.Sikwi kondwi PIE, ansanm ak akizisyon done TSCPC, te pèmèt aplikasyon yon filtè pondération pou tout lavi ki ede elimine background ak diafonik espektral.Yo te korije entansite flare ki te chwazi lè l sèvi avèk papòt ki anwo yo lè l sèvi avèk siyal background mwayèn yo detèmine nan istogram ensidan an parapò ak entansite/bin nan echantiyon tanpon sèlman yo.Eklatman ki asosye ak gwo total anjeneral okipe plizyè posode youn apre lòt nan tras tan an (mete a 1 ms).Nan ka sa yo, yo te chwazi yon bin ki gen fòs maksimòm.Pou analiz FRET ak stoichiometric, teyorikman detèmine gamma faktè γ (0.517) yo te itilize.Spectral crosstalk ak kontribisyon eksitasyon dirèk yo neglijab (detèmine eksperimantal) nan pouvwa a lazè eksitasyon itilize.Efikasite ak estekiometri FRET nan yon eksplozyon kalkile jan sa a.