310 10 * 1mm Nerjaveèi asye mawonnen tib eleman chimik, domèn yo N-tèminal nan spidroin fòme idrojèl ki baze sou fibril amiloid epi yo bay yon platfòm pou imobilizasyon pwoteyin.

Mèsi paske w vizite Nature.com.W ap itilize yon vèsyon navigatè ak sipò CSS limite.Pou pi bon eksperyans, nou rekòmande pou w sèvi ak yon navigatè ki ajou (oswa enfim mòd konpatibilite nan Internet Explorer).Anplis de sa, asire sipò kontinyèl, nou montre sit la san estil ak JavaScript.
Koulis ki montre twa atik pou chak glisad.Sèvi ak bouton dèyè yo ak bouton kap vini yo pou w deplase nan glisad yo, oswa bouton kontwolè glisad yo nan fen pou deplase nan chak glisad.

Spesifikasyon

310 10 * 1mm Nerjaveèi asye mawonnen tib founisè

Konpozisyon chimik

Pwopriyete mekanik

Pwoteyin swa Spider recombinant (pwoteyin swa Spider) gen anpil aplikasyon potansyèl nan devlopman nouvo biomateryèl, men nati multimodal yo ak agrégation ki gen tandans fè yo difisil pou jwenn ak fasil pou itilize.Isit la nou rapòte ke recombinant tipòtrè pwoteyin spidroin ak, sa ki enpòtan, domèn N-tèminal (NT) tèt li rapidman fòme idrojèl oto-sipòte ak transparan nan 37 °C.pwoteyin fizyon ki gen ladan NT ak vèt fliyoresan pwoteyin oswa purin nukleozid fosforilaz fòme pwoteyin fizyon konplètman fonksyonèl.Idwojèl.Rezilta nou yo montre ke recombinant NT ak pwoteyin fizyon bay pwodiksyon ekspresyon segondè ak dote idwojèl ak pwopriyete atire tankou transparans, jelasyon san retik, ak imobilizasyon dirèk nan pwoteyin aktif nan dansite segondè.
Areye yo gen sèt seri diferan nan glann swa, chak pwodwi yon kalite espesifik swa.Tout sèt espès swa yo konpoze de pwoteyin swa Spider (spidroins) apeprè 6000 résidus long epi yo genyen yon gwo rejyon repete santral ki antoure pa domèn N- ak C-tèminal esferik (NT ak CT)1,2.Kalite swa ki pi etidye, prensipal anpoul la, se glann prensipal la ki pwodui.Nan glann sa a, yon monokouch nan selil epitelyal sentèz pwoteyin spidroin epi sekrete yo nan lumèn nan glann, kote yo prezan nan yon fòm idrosolubl (dopaj) nan konsantrasyon trè wo (30-50% w / v)3,4.Òganizasyon ak konfòmasyon prensipal pwoteyin spidroin ampullar yo nan glann lan te deba, men pifò prèv eksperimantal endike prezans yon konformasyon elikal jeneralman e/oswa o aza ak estrikti micellar oswa lamellar5,6,7,8,9,10.Pandan ke domèn yo repete kontwole pwopriyete mekanik nan fib swa, fòme nanokristal β-fèy ak estrikti amorphe11,12,13,14,15, domèn fen kontwole fib swa an repons a kondisyon chanje ansanm glann swa a16,17,18.Lè yo kontwole fòmasyon swa, 19. Domèn tèminal yo konsève evolisyonèman epi fonksyon yo ka komen nan tout pwoteyin spidroin 2,20,21.Pandan pasaj nan glann lan, pH spidroin diminye soti nan apeprè 7.6 a < 5.716 epi li ogmante ak taye ak detire medyatè pa mouvman nan kanal la piti piti.Nan solisyon, CT se yon α-helical konstititif paralèl dimer17, men an repons a ba pH ak fòs taye, CT dewoulman ak chanje β-kouch16, 17, pètèt deklanche β-kouch nan rejyon yo repete nan Konvèti 16. NT yo se monomerik anba. kondisyon ki reflete kondisyon nan lumèn nan glann ak medyatè solubility nan spidroin, men nan pH redwi, protonasyon nan yon kantite chenn bò asid karboksilik mennen nan dimerization nan NT ak yon pKa nan apeprè 6.5, kidonk estabilize NT ak fikse spidroin nan gwo. kantite.rezo16,18.Kidonk, NT jwe yon wòl kle nan fòmasyon filaman, chanje soti nan yon monomè nan kouch nan yon dimè nan fib la 23,24,25.NT rete trè idrosolubl ak hélicoïdal nan tout kondisyon etidye nan dat16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29, ki enspire devlopman li kòm yon etikèt ki amelyore solubilite pou pwodiksyon an nan pwoteyin eterològ.
Pwoteyin swa rekombinan mini Spider, ki fòme ak yon sèl NT, yon rejyon kout repete, yon sèl CT, ak yon tag His6 (His-NT2RepCT) pou pirifye, se tankou idrosolubl nan tanpon akeuz tankou pwoteyin swa natif natal Spider ak imite karakteristik natif natal nan arenyen swa. .pwoteksyon 25.31.His-NT2RepCT ka file nan fib kontinyèl lè l sèvi avèk yon machin biomimetic nan ki se yon kouch pH 8 idrosolubl ekstrè nan yon beny dlo pH 525,32,33,34,35.Bioreactor fèmantasyon nan E. coli eksprime His-NT2RepCT ak apre tretman apre yo te lakòz > 14 g / L sede apre pirifikasyon.Se NT23, 25, 34, pwodiksyon an segondè, solubilite segondè, ak repons adekwat His-NT2RepCT nan kondisyon asid.
Isit la nou rapòte fòmasyon rapid nan idrojèl transparan soti nan pwoteyin spidroin recombinant, ki gen ladan NT pou kont li, pa enkubasyon yon solisyon pwoteyin nan 37 °C.Sèvi ak thioflavin T fluoresans (ThT), Fourier transfòme enfrawouj spectroscopie (FTIR), nikleyè mayetik sonorite spectroscopy (NMR) ak transmisyon mikwoskopi elèktron (TEM), nou te jwenn ke NT ak pwoteyin mikwospider sibi transfòmasyon estriktirèl nan β-dra ak fibrils ki tankou amiloid. lè jèl yo fòme.Anplis de sa, pwoteyin fizyon nan NT ak pwoteyin vèt fliyoresan (GFP) oswa purin nukleozid fosforilaz (PNP) fòme idrogel ak fragman fizyon konplètman fonksyonèl.Ekspresyon wo-debi nan lame heterologous, makonnen ak fòmasyon rapid nan idrojèl anba kondisyon fizyolojik, ouvè posiblite pou pwodiksyon pri-efikas nan idrojèl ak fonksyon Enjenieri.
Kontrèman ak pifò pwoteyin spidroin recombinant rapòte36, His-NT2RepCT estab nan tanpon Tris-HCl nan pH 8 epi li ka konsantre jiska 500 mg/mL san presipitasyon25.Se poutèt sa, nou te sezi jwenn ke pwoteyin sa a rapidman fòme optik klè, oto-sipòte idrojèl lè enkubasyon nan 37 ° C (Fig. 1b-d).Plis etid yo te montre ke jelasyon His-NT2RepCT te fèt sou yon pakèt konsantrasyon pwoteyin (10-300 mg / mL) e ke konsantrasyon sa a te envers korelasyon ak tan jelasyon (figi 1c ak Figi siplemantè 1).Pou chèche konnen ki pati nan His-NT2RepCT medyatè fòmasyon idrogel, nou answit egzamine chak domèn endividyèlman ak nan divès konbinezon lè l sèvi avèk yon tès envèsyon flakon (Figi 1a, b).Tout fraksyon teste nan spidroin recombinant fòme jèl (nan yon konsantrasyon pwoteyin nan 300 mg / mL) nan mwens pase 1 èdtan, eksepte pou presipite 2Rep (Fig. 1b).Sa a sijere ke NT ak CT poukont yo, nan konbinezon, oswa ki asosye ak repete, ka jele nan 37 ° C e ke tag His6 la pa afekte pwosesis sa a nan okenn limit enpòtan.Etandone nosyon komen ke NT se yon pwoteyin trè idrosolubl ak ki estab, e ke rapò anvan yo nan idrogel spidroin recombinant te atribiye efè jelasyon nan chanjman konformasyon nan rejyon repete ak / oswa CTs, NT tèt li te kapab.Dekouvèt jelasyon an te inatandi.Tablo siplemantè 1) 37, 38, 39. Remakab, NT deja gelled nan 10 minit nan yon konsantrasyon ≥ 300 mg / mL (Fig. 1c).Eksperyans envèsyon flakon ak divès kalite konsantrasyon nan NT te montre ke nan> 50 mg / mL solisyon an NT gelled pi vit pase His-NT2RepCT nan konsantrasyon ki koresponn lan (w / v, Figi 1c).
Reprezantasyon eskematik divès kalite konstri spidroin etidye nan travay sa a.b Tan jèl nan 37 °C pou divès pwoteyin recombinant spidroin (300 mg/mL) verifye pa ranvèse flakon an.CT jèl imedyatman san enkubasyon (<300 mg/mL), 2Rep presipite (300 mg/mL, 5 mm echèl).c Tan jèl nan His-NT2RepCT ak NT nan konsantrasyon pwoteyin endike nan 37 ° C.d Foto idwojèl His-NT2RepCT ak NT ak arenyen an ak lèt ​​"NT" enprime anba, respektivman (tou de 200 mg/mL, ba echèl 5 mm).
Idwojèl ki fòme pa divès kalite pwoteyin spidroin recombinant gen koulè yon ti kras diferan, ak obsèvasyon je toutouni montre diferan degre transparans (Fig. 1b).Jèl NT yo eksepsyonèlman klè pandan ke lòt jèl vin opak.His-NT2RepCT ak NT jèl jete nan tib silendrik ta ka retire nan mwazi an entak (figi 1d).
Pou teste si wi ou non natirèl arenyen kouch swa jèl anba kondisyon kounye a yo te jwenn ki lakòz jelasyon nan pwoteyin yo spidroin recombinant, kouch yo te kolekte nan glann nan gwo ampulla nan arenyen an pon Swedish (Larinioides sclopetarius).Kouch yo te estoke nan 20 mM Tris-HCl tanpon nan 50 mg / mL (ki baze sou pwa sèk mezire), men pa gen okenn jelasyon yo te obsève pandan enkubasyon 21 jou a nan 37 ° C (figi siplemantè 2a).
Pou mezire jèl sa yo, yo ka itilize mezi reolojik pou etidye pwosesis jelasyon an epi detèmine pwopriyete mekanik jeneral yo.An patikilye, siveyans modil depo (elastisite) nan tanperati ki wo ka bay enfòmasyon sou tanperati gelling la ak pwopriyete viscoelastic kouch la.Eksperyans ogmantasyon tanperati (lè l sèvi avèk 1 ° C / min nan 25-45 ° C, ki baze sou etid anvan yo itilize solisyon stock swa natirèl) 40,41 te montre ke modil yo depo nan solisyon His-NT2RepCT ak NT ogmante ak ogmante tanperati.te ogmante (figi 2 ak Figi siplemantè 3).Miyò, modil la NT te kòmanse grandi nan yon tanperati ki pi ba konpare ak His-NT2RepCT, ki konsistan avèk tan an jèl pi vit obsève lè NT te enkubate dirèkteman ak His-NT2RepCT nan 37 ° C (Figi 1).Apre yon gout ki vin apre nan tanperati, modil depo a pa t 'tounen nan pi ba valè epi li te rete pi wo a modil la pèt (gade Fig. 3 siplemantè), ki endike tèmik irevokabl jèl ki estab.Apre jelasyon, modil elastik final la te varye ant 15 a 330 kPa pou idwojèl His-NT2RepCT nan yon konsantrasyon 100-500 mg/mL, ak modil elastik final la pou idwojèl NT (100-500 mg/mL) te varye ant 2 ak 1400. kPa (figi, 2 ak done ranp konplè) gade Figi siplemantè 3).
a Chanjman nan tanperati pandan mezi His-NT2RepCT (300 mg/mL) ak b NT (300 mg/mL) ak souke.Flèch yo endike tandans tanperati a, ak lonbraj ki pi lejè nan done modil depo yo montre tès nan pi ba valè koupl pou enstriman an pase sa manifakti a espesifye, ki se kòz bri a ogmante.c Fin-modil akimilasyon His-NT2RepCT ak NT apre tanperati ki wo (100, 300, ak 500 mg/mL).Tout lekti modil yo pran nan yon frekans 0.1 Hz.
Kòm yon metòd potansyèl pou mennen ankèt sou chanjman konformasyon ki asosye ak jelasyon, nou anrejistre espèk FTIR nan His-NT2RepCT ak NT anvan ak apre jelasyon nan 37 ° C (Figi 3a, b).Kòm espere, spèkt yo nan solisyon His-NT2RepCT ak NT koresponn ak pwoteyin ki montre α-helix / bobin o aza estrikti segondè, ak yon bann pwononse nan 1645 cm-1.Pou tou de idwojèl, jelasyon te lakòz fòmasyon de bra nan mitan gwoup mwen an sou 1617 cm-1 ak 1695 cm-1 (figi 3a, b), ki endike fòmasyon nan estrikti antiparalèl β-fèy.Chanjman sa yo ka wè klèman tou nan dezyèm dérivés respektif yo ak espèk jeelasyon diferans (figi siplemantè 4b).De Gwoup Mizik NT β-kouch la te pi pwononse pase sa yo ki nan His-NT2RepCT, ki endike ke kontni an total nan gwoup β-kouch nan NT idwojèl la te pi wo pase sa yo ki nan idrogel NT2RepCT la.
yon spectre absòpsyon FTIR nan His-NT2RepCT ak b NT (tou de 500 mg/mL) anvan (solisyon) ak apre (jèl) enkubasyon nan 37 ° C.c TEM imaj nan jèl NT2RepCT 50 mg/ml ki te resuspende ak d NT.Ba echèl 200 nm.e Dyamèt fib nan idwojèl His-NT2RepCT ak NT.n = 100 fibrils mezire, p <0.0001.Ba erè yo montre devyasyon estanda a.Sant ba erè yo se vle di.Yo te itilize yon tès t ki pa pè (de-tailed) pou analiz estatistik.f ThT fliyoresans divès kalite pwoteyin spidroin recombinant (100 mg/mL) nan 37 °C san yo pa souke.g NT (100 mg/mL) eksperyans inokulasyon soti nan 100 mg/mL NT jèl ak 0%, 5%, 10%, ak 20% grenn.
Analiz de jèl la lè l sèvi avèk mikwoskospi elektwonik transmisyon (TEM) te montre ke idwojèl la konsiste de fibril amiloid ki sanble (figi 3c, 3d).Fibril NT ki te fòme yo te long (5-12 nm an dyamèt) ak unbranched, pandan y ap fibril His-NT2RepCT yo te pi kout nan longè ak siyifikativman pi laj an dyamèt (7-16 nm) (Fig. 3e).Rezilta sa yo te pèmèt nou swiv sinetik fibwoz la lè l sèvi avèk thioflavin T (ThT) tès la.Pou tout pwoteyin spidroin recombinant, siyal fliyoresan an ogmante lè echantiyon yo te enkube nan 37 ° C (Fig. 3f, Figi Siplemantè 5a).Konfòm ak konklizyon sa a, egzamen mikwoskopik NT ak His-NT2RepCT anba kondisyon gelling te revele yon ogmantasyon inifòm nan fluoresans ThT san akimilasyon lokal aparan nan total ThT-pozitif (figi siplemantè 5b, c).Fòmasyon ThT-pozitif fibrils pa te akonpaye pa yon ogmantasyon nan NT ak His-NTCT turbidity (Siplemantè Fig. 5d), ki vle di ke yon rezo fibrils nan jèl la ka fòme san yo pa konpwomèt klè jèl.Plante lè yo ajoute ti kantite fibril pre-fòme ka siyifikativman akselere fòmasyon fibril nan kèk amyloids42,43,44 men ajoute 5%, 10% oswa 20% (w / w) NT nan yon solisyon nan idrokoagulan NT.efè simen (figi 3g).Petèt sa a se akòz lefèt ke fibrils yo nan idwojèl la relativman fiks epi yo pa ka itilize kòm grenn.
Konpòtman an inatandi nan pwoteyin spidroin recombinant nan tanperati ki wo pouse plis etid espèktroskopi nikleyè sonorite mayetik (NMR) yo idantifye chanjman konformasyon ki asosye ak fòmasyon jèl.Spectre NMR nan solisyon His-NT2RepCT anrejistre sou tan nan 37 ° C te montre ke CT te toujou pasyèlman pliye, tandiske NT ak 2Rep siyal yo te disparèt (Fig. 4a), sijere ke li te sitou NT ak 2Rep ki pasyèlman kontwole fòmasyon nan His- NT2RepCT idwojèl.Siyal CT a te atténue tou a 20% nan entansite orijinal li, ki sijere ke CT se tou sitou fiks ak enkòpore nan estrikti nan idrogel.Pou yon pòsyon ki pi piti nan CT a, ki se tankou mobil tankou nan echantiyon an preincubated e konsa obsève pa solisyon NMR, spectre yo manke siyal pou 10 premye résidus estriktire yo, petèt akòz imobilizasyon difisil nan pòsyon ki tache nan His-NT2Rep.Spectre RMN yo nan eta a nan idwojèl -NT2RepCT revele prezans nan dominan nan α-helis ak β-kouch ak, nan yon limit pi piti, konfòmasyon nan bobin o aza (figi 4b).Analiz chanjman chimik nan rezidi methionine prezan sèlman nan NT te montre ke domèn sa a te konvèti nan yon estrikti β-fèy.Spectre yo ki depann de tan nan NT nan solisyon te montre yon diminisyon inifòm nan entansite siyal (figi 4c), ak solid-eta RMN nan idrojèl NT te montre ke pi fò nan résidus NT yo te konvèti nan estrikti β-fèy (figi 4d).Konfòmasyon 2Rep pa t 'kapab detèmine separeman akòz tandans li nan total.Sepandan, spectre solid eta RMN yo nan idwojèl NTCT ak His-NT2RepCT te sanble anpil (figi 4b; Figi siplemantè 6b), sijere ke 2Rep kontribye ti kras nan pati estriktirèl idwojèl His-NT2RepCT la.Pou idwojèl CT, α-helis, β-draj, ak estrikti segondè o aza elikal yo te jwenn egziste (Siplemantè Fig. 6d).Sa a sijere ke kèk pati nan CT a rete α-helis pandan ke lòt yo vin β-dra.Kidonk, rezilta yo nan espektroskopi NMR sijere ke NT enpòtan pou fòmasyon idrogel epi tou li transfòme nan yon konformasyon β-fèy sou fizyon ak 2Rep ak CT.Konfòm ak sa a, nou dènyèman te jwenn ke zip espasyal amiloid gen anpil chans fòme nan tout senk elis nan domèn nan NT, ak algorithm nan Waltz prevwa yon rejyon amyloidogenic nan Helix 1 (Fig. 4e).
2D spectre nan 15N-HSQC 10 mg/mL His-NT2RepCT solisyon anvan (ble) ak 19 èdtan apre enkubasyon (wouj) nan 37 ° C.Pik kwa endividyèl yo nan spectre wouj la ak F24, G136, polyA nan spectre ble a yo endike pa senbòl yon sèl lèt asid amine ak nimewo rezidi yo.Ensèk yo montre depandans entansite siyal la sou tan pou résidus chwazi nan domèn NT, 2Rep, ak CT.b Spectre radyofrekans eta solid (RFDR) nan idwojèl His-NT2RepCT.Yo te detèmine korelasyon résidus Cα/Cβ yo obsève nan espèk RFDR pa konparezon ak chanjman chimik modèl peptide ak valè ki sòti nan estatistik82,83 ak estrikti segondè yo.SSB la vle di wotasyon sideband.c Spectre yon dimansyon nan solisyon 15N-HSQC 10 mg/mL NT pandan enkubasyon nan 37 °C pou 36 èdtan.Inset la montre entansite volumetrik kont tan.d Spectre RFDR eta solid nan idwojèl NT.Yo endike korelasyon résidus Cα/Cβ yo ak estrikti segondè yo obsève nan espèk RFDR yo.e Ki baze sou pwofil tandans fibrilasyon NT45.79 ki soti nan baz done Zipper (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).Enèji Rosetta nan fenèt chanjman espasyal zèklè hexapeptide la montre an kcal/mol.Ba wouj yo vle di hexapeptides ak yon gwo tandans fibwoz (enèji Rosetta anba a -23 kcal/mol; anba liy pwentiye a).Ba vèt yo endike fragman ak enèji Rosetta pi wo pase papòt la ak Se poutèt sa mwens chans yo fòme zip esterik.Fragman ki gen prolin yo te eskli nan analiz la (san kolòn).Kare yo endike zòn amiloidoz prevwa pa algorithm Waltz81 (https://waltz.switchlab.org).Sekans nan résidus asid amine nan NT se nan tèt la, ak kalite résidus yo te jwenn nan estrikti segondè β (detèmine pa espektroskopi RMN solid-eta) yo montre an wouj.Pozisyon senk NT α-helis yo deziyen kòm (H1-H5)28.
Nan pH <6.5, HT dimerize, yo te rezistan a chalè- oswa ure-induit denaturation18.Pou eksplike kijan NT dimerization ak estabilite afekte jelasyon, solisyon ki gen 100 mg / ml NT yo te kontwole nan pH 8, 7, ak 6 lè l sèvi avèk tès la envèsyon flakon.Echantiyon NT enkubate nan pH 8 ak 7 gelled apre 30 min nan 37 °C, men jèl pH 8 la te rete klè, pandan y ap jèl pH 7 te montre yon presipite vizib (figi 5a).Kontrèman, yon solisyon ki gen HT nan pH 6 pa t fòme yon jèl, epi yo ka wè yon gwo presipite apre 20 min nan 37 ° C.Sa a sijere ke dimers tèt yo ak/oswa pi wo estabilite yo konpare ak monomè yo anpeche jelasyon.Fòmasyon yon presipite pou NT nan pH 7 ak 6 pa te espere, depi yo te rapòte ke NT se idrosolubl nan 200 mg / ml27, fasil repliye apre denaturasyon chalè, epi tou li kenbe yon α-helix nan pi ba valè nan. pH 18. Yon eksplikasyon pwobab pou diferans sa yo se ke eksperyans yo te rapòte anvan yo te pote soti nan tanperati chanm oswa pi ba, oswa nan konsantrasyon relativman ba pwoteyin16,18,19.
Tès envèsyon flakon NT (100 mg/mL) nan pH 8, 7, 6 ak 154 mM NaCl (pH 8) apre enkubasyon nan 37 ° C.b NT CD spectre ak ak san 154 mM NaF ak 154 mM NaCl, respektivman.Elipsite molè nan 222 nm konvèti nan yon pwopòsyon de pli natirèl.c NT envèrsyon esè (100 mg/mL) NT* (37 °C ak 60 °C), NTA72R (37 °C), ak His-NT-L6 (37 °C ak 60 °C).d Spectre CD nan NT mutan NT*, NTA72R, ak His-NT-L6.Elipsite molè nan 222 nm konvèti nan yon pwopòsyon de pli natirèl.e Tès Envèsyon NTFlSp, NTMiSp ak redwi NTMiSp (100 mg/mL).Echèl ba 5 mm.f CD spectre nan NT, NTFlSp, NTMiSp ak redwi NTMiSp.Elipsite molè nan 222 nm konvèti nan yon pwopòsyon de pli natirèl.Tout espèk NT nan 25 °C ak 95 °C yo montre nan Figi Siplemantè 8.
Konsantrasyon sèl fizyolojik detèmine entèraksyon elektwostatik ant subinite NT ak dimerizasyon transfè NT nan pi ba pH18.Nou te jwenn ke prezans nan 154 mM NaCl ak NaF te tout bon anpeche jelasyon, respektivman (Fig. 5a, b; Fig. Siplemantè 2b) e ke sèl sa yo ogmante estabilite nan tèmik nan monomè NT (Fig. 5b, Fig. Siplemantè 8) .Li sijere tou ke amelyorasyon estabilite, olye ke dimerization, anpeche fòmasyon jèl.
Pou plis eksplore wòl nan dimerization pwoteyin ak estabilite nan jelasyon, nou te itilize de mutan, NT * ak NTA72R, ki tou rete monomerik nan pH 28.30 ki ba.NT* se yon mutant ranvèse chaj doub kote distribisyon chaj dipolè aparan monomè a ap aplati, sa ki anpeche dimerizasyon ak ogmante estabilite monomè.NTA72R se yon dipol chaje, men Ala Arg-ranplase sitiye nan fwontyè a dimè, kidonk mitasyon entèfere ak entèraksyon sou-inite ki nesesè pou dimerizasyon.Lè yo enkubasyon nan 37 ° C, NT * pa t 'fòme yon idwojèl, pandan y ap NTA72R fòme yon jèl opak pou 15 min (Fig. 5c).Piske tou de NT* ak NTA72R pa ka dimerize men diferan nan estabilite monomè (figi 5d), rezilta sa yo sijere ke gwo estabilite thermodynamic anpeche NT jele.Sa a se sipòte tou pa lefèt ke HT * fòme yon jèl lè li enstab nan tanperati ki wo (apre 8 min nan 60 ° C; Fig. 5c).Li te deja montre ke kontni an segondè nan methionine nan NT likide plisman natirèl li yo ak ke sis Met to Leu ranplasan (ki refere isit la kòm His-NT-L6) fòtman estabilize monomè NT46 la.Ki baze sou sipozisyon ke fleksibilite estriktirèl obligatwa pou fòmasyon jèl NT, nou te jwenn ke mutan ki estab His-NT-L6 pa t 'jèl nan 37 ° C (Figi 5c, d).Sepandan, His-NT-L6 te fòme tou yon jèl sou enkubasyon nan 60 ° С pou 60 min (Fig. 5c).
Kapasite NT pou transfòme nan estrikti β-fèy ak fòme idrogel parèt pou aplike nan kèk men se pa tout domèn NT nan spidroin.NT ki soti nan diferan kalite swa ak espès Spider, Trichonephila clavipes (NTFlSp), te fòme jèl malgre kontni relativman ba methionine yo ak estabilite tèmik segondè (figi 5e, f ak Tablo siplemantè 2).Kontrèman, NT ki soti nan ti ampullar pwoteyin spidroin ki soti nan Araneus ventricosus (NTMiSp) ak estabilite tèmik ki ba ak kontni methionine segondè pa t 'fòme idrogel (Tablo siplemantè 2 ak Fig. 5e, f).Lèt la ka asosye ak prezans lyezon disulfid intramolecular29,47.Toujou, lè lyezon disulfide NTMiSp yo te redwi, li te fòme yon idwojèl apre enkubasyon nan 37 ° C pou 10 min (Fig. 5e).An konklizyon, li ta dwe remake ke fleksibilite estriktirèl se yon enpòtan, men se pa sèlman, kritè pou fòmasyon nan yon jèl soti nan NT.Yon lòt faktè ki ka enpòtan se tandans pou fòme fibril amiloid, ak analiz ak baz done zip la ak algorithm Waltz te montre yon korelasyon ant kapasite pou fòme jèl ak prezans rejyon amiloidjenik yo, osi byen ke limit rejyon yo prevwa. pou fòme zip esterik.Te gen yon korelasyon (Tablo Siplemantè 2 ak Figi Siplemantè 9).
Kapasite NT pou fòme fibrils ak fòme jèl nan kondisyon favorab te mennen nou nan ipotèz ke fizyon NT ak lòt fragman pwoteyin ka toujou fòme jèl ak fonksyon konplè nan patnè fizyon.Pou teste sa a, nou te entwodwi vèt fliyoresan pwoteyin (GFP) ak purin nukleozid fosforilaz (PNP) nan tèminal C nan NT la, respektivman.Pwoteyin fizyon ki kapab lakòz yo te eksprime nan E. coli ak pwodiksyon final trè wo (150 mg/L ak 256 mg/L kilti flacon souke pou His-NT-GFP ak His-NT-PNP, respektivman), ki konsistan avèk sa yo te montre. pou Lòt pwoteyin kole ak NT Ref.30. Pwoteyin fizyon His-NT-GFP (300mg/mL) ak His-NT-PNP (100mg/mL) te fòme jèl apre 2 èdtan ak 6.5 èdtan nan 37 ° C epi, sa ki enpòtan, fraksyon GFP rete san okenn chanjman.obsève apre jelasyon, ak> 70% nan entansite fluoresans inisyal la ki rete apre jelasyon (Fig. 6a).Pou mezire aktivite PNP nan solisyon his-NT-PNP ak jèl, nou te oblije delye pwoteyin fizyon an ak NT paske aktivite anzimatik preparasyon pi a te andeyò seri deteksyon tès la nan konsantrasyon gelling.Jèl ki te fòme ak yon melanj ki genyen 0.01 mg/mL His-NT-PNP ak 100 mg/mL NT kenbe 65% nan aktivite anzimatik inisyal echantiyon yo preincubated (Fig. 6b).Jèl la rete entak pandan mezi a (figi siplemantè 10).
a Entansite fliyoresan relatif anvan ak apre jelasyon His-NT-GFP (300 mg/mL) ak flakon Envèse ki gen Hydrogel His-NT-GFP (300 mg/mL) anba limyè vizib ak UV.Pwen yo montre mezi endividyèl (n = 3), ba erè montre devyasyon estanda.Valè mwayèn yo montre nan sant ba erè yo.b Aktivite PNP te jwenn pa analiz fliyometrik lè l sèvi avèk solisyon ak jèl ki gen ladan NT (100 mg / ml) ak yon melanj ki gen 0.01 mg / ml his-NT-PNP ak 100 mg / ml nouvo dola Taiwan.Ankadreman an montre yon flakon Envèse ki gen yon idwojèl ki gen His-NT-PNP (ba echèl 5 mm).
Isit la, nou rapòte fòmasyon idrojèl soti nan NT ak lòt pwoteyin spidroin recombinant pa enkubasyon yon solisyon pwoteyin nan 37 ° C (Figi 1).Nou montre ke jelasyon asosye ak transfòmasyon nan α-helis nan β-kouch ak fòmasyon nan fibrils tankou amiloid (figi 3 ak 4).Konklizyon sa a se etone paske NT yo se pakèt globilè senk-helix anroule li te ye pou solubilite ekstrèmman wo yo ak gwo estabilite nan konsantrasyon > 200 mg/mL nan 4 ° C pandan plizyè jou27.Anplis de sa, NT yo fasilman repliye apre denaturasyon chalè nan konsantrasyon pwoteyin ki ba nan µM.Dapre rezilta nou yo, fòmasyon fibril mande pou yon konbinezon de> 10 mg / mL konsantrasyon pwoteyin ak tanperati yon ti kras elve (figi 1).Sa a konsistan avèk lide ke fibril amiloid ka fòme nan pwoteyin globularly ki plwaye ki nan yon eta pasyèlman depliye akòz fluctuations tèmik nan kondisyon fizyolojik 48 .Egzanp pwoteyin ki sibi konvèsyon sa a gen ladan ensilin49,50, β2-mikroglobulin, transthyretin ak lysozyme51,52,53.Malgre ke NT se yon α-helix nan eta natif natal li, apeprè 65% nan chèn polypeptid la konpatib ak fòmasyon zip esterik (Fig. 4e) 45 .Depi monomè a se dinamik mobil46, li ka ekspoze rejyon amiloidogenic potansyèl sa yo nan tanperati modere elve ak nan gwo konsantrasyon nan pwoteyin total ka rive nan yon konsantrasyon kritik pou fòmasyon fibril amiloid54.Apre rezònman sa a, nou te jwenn yon korelasyon negatif ant konsantrasyon spidroin ak tan jelasyon (Fig. 1c), epi si konfòmasyon monomerik NT estabilize swa pa mitasyon (NT*, His-NT-L6) oswa pa adisyon sèl, ka anpeche a. fòmasyon idrojèl (figi 5).
Nan pifò ka yo, fibril amiloid disparèt nan solisyon kòm yon presipite, men nan sèten kondisyon yo ka fòme idrojèl55,56,57.Fibril ki fòme idwojèl tipikman gen yon rapò aspè wo epi fòme rezo ki estab ki genyen twa dimansyon atravè entanglement molekilè,55,58 ki konsistan avèk rezilta nou yo.Pou fòmasyon idwojèl nan vitro, pwoteyin yo souvan depliye totalman oswa pasyèlman, pou egzanp, pa ekspoze a solvang òganik, tanperati ki wo (70-90 ° C) ak / oswa pH ki ba (1.5-3.0) 59,60,61,62.Idwojèl spidroin ki dekri isit la pa mande pou tretman piman bouk, ni yo pa mande pou ajan kwaze pou estabilize idrogel yo.
Li te deja rapòte ke spidroin repete ak QDs, ki parèt yo sibi β-fèy chanje pandan swa k ap vire, fòme idrogel.Konpare ak konklizyon nou yo, tan enkubasyon ak / oswa tanperati enkubasyon yo te siyifikativman pi long oswa pi wo, respektivman, epi idrogel yo ki te lakòz yo te souvan opak (Figi 7 ak Tablo Siplemantè 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. Anplis tan rapid jèl, NT idwojèl > 300 mg/mL (30%) depase tout lòt idrojèl pwoteyin swa Spider recombinant ki dekri, osi byen ke idrojèl natirèl tankou jelatin, aljinat (2%), agar (0.5%). ) ak kolagen an.(0.6%) (Figi 7 ak Tablo Siplemantè 1 ak 3)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
Tan jèl la ak modil elastik idrojèl yo nan etid sa a te konpare ak lòt idrojèl ki baze sou spidroin ak idrojèl natirèl chwazi.Referans yo bay ansanm ak yon deskripsyon kondisyon jelasyon yo.APS persulfat amonyòm, tanperati chanm.Done 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
Areye yo sanble yo te devlope fason pou anpeche spidroin jele pandan depo.Malgre gwo konsantrasyon pwoteyin nan glann swa, gwo rejyon repete ki asosye ak domèn tèminal la vle di konsantrasyon aparan NT ak CT nan glann lan koresponn ak apeprè 10-20 mg/ml, nan limit etid sa a.obligatwa pou fòmasyon idrogel obsève in vitro.Anplis de sa, konsantrasyon ki sanble nan sèl 16 estabilize NT, tankou nan glann swa (figi 5b).Konfòmasyon NT te etidye nan E. coli cytosol la epi li te jwenn yo dwe plis byen sere pase lè egzamine nan vitro, plis endike ke sèl oswa lòt faktè anpeche agrégation li yo nan vivo.Sepandan, kapasite NT yo pou transfòme nan fibrils β-fèy ka enpòtan pou fòmasyon filaman epi yo ta dwe envestige nan etid nan lavni.
Anplis aspè roman NT-amyloid-tankou fòmasyon fibril ak idrogel yo obsève nan etid sa a, nou montre tou ke fenomèn sa a ka gen aplikasyon biotechnologique ak byomedikal (figi 8).Kòm yon prèv konsèp, nou konbine NT ak GFP oswa PNP epi te montre ke pwoteyin fizyon an tou fòme idrojèl lè enkubasyon nan 37 ° C e ke fraksyon yo GFP ak PNP lajman kenbe aktivite yo apre jelasyon (Figi 6).Fosforilaz nukleozid yo se sentèz katalis enpòtan nan analogu nukleozid75, sa ki fè dekouvèt nou an enpòtan pou endistri biopharmaceutique.Konsèp eksprime pwoteyin fizyon ki fòme idrojèl transparan nan kondisyon favorab pèmèt kreyasyon idrojèl fonksyonalize ak pwopriyete favorab pou yon pakèt aplikasyon tankou imobilizasyon anzim, lage dwòg kontwole ak jeni tisi.Anplis de sa, NT ak NT * se makè ekspresyon efikas30, ki vle di ke NT ak varyant li yo ka itilize pou pwodiksyon wo-debi nan pwoteyin fizyon idrosolubl ak kreyasyon ki vin apre nan pwoteyin sib immobilize nan idrojèl 3D.
NT se idrosolubl, α-helical ak ki estab nan konsantrasyon ki ba (µM) ak 37 ° C.Nan menm tanperati a, men nan ogmantasyon konsantrasyon (> 10 mg / ml), NT fòme jèl ki fòme ak fibril ki sanble ak amiloid.Pwoteyin fizyon NT yo fòme tou jèl fibrilè ak fragman fizyon totalman fonksyonèl, sa ki pèmèt divès kalite pwoteyin yo dwe imobilize nan idwojèl 3D lè l sèvi avèk NT.Anba: NT (PDB: 4FBS) ak ilistrasyon rezo fib ak estrikti pwoteyin ki asosye (sipoze epi yo pa trase nan echèl, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210/pdb4RJ2/pdb).
Konstwi yo (gade Tablo Siplemantè 4 pou yon lis konplè ki gen ladan sekans asid amine) yo te klonaj nan plasmid pT7 ak transfòme nan E. coli BL21 (DE3).E. coli ki gen plasmid enjenyè yo te vaksinen nan bouyon Luria ki te konplete ak kanamycin (70 mg / l) epi yo te grandi lannwit lan nan 30 ° C ak 250 rpm.Lè sa a, kilti a te vaksinen 1/100 nan mwayen LB ki gen kanamycin ak kiltive nan 30 ° C ak 110 rpm jiskaske OD600 la rive nan 0.8.Pou etid NMR, bakteri yo te grandi nan mwayen M9 minimòm ki gen 2 g D-glikoz 13C (Aldrich) ak 1 g klori amonyòm 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) pou etikèt pwoteyin ak izotòp.Bese tanperati a a 20 degre Sèlsiyis epi pwovoke ekspresyon pwoteyin ak 0.15 mM isopropylthiogalactopyranoside (konsantrasyon final).Apre ekspresyon pwoteyin lannwit lan, selil yo te rekòlte nan 7278 × g, 4 ° C pou 20 min.Granules selil yo te resuspend nan 20 mM Tris-HCl, pH 8, ak frizè jiskaske yo itilize plis.Selil ki dekonjle yo te lysed lè l sèvi avèk yon disruptor selil (machin seri TS, Constant Systems Limited, Angletè) nan 30 kPa.Lè sa a, lisat yo te santrifuje nan 25,000 g pou 30 minit nan 4 ° C.Pou NTMiSp, granules la te resuspend nan 2 M ure, 20 mM Tris-HCl, pH 8, ak sonike pou 2 min (2 s sou / koupe, 65%), Lè sa a, santrifuje ankò nan 25,000 xg, 4 ° C. 30 min.Sipènatant la te chaje sou yon kolòn Ni-NTA, lave ak 20 mM Tris-HCl, 2 mM imidazol, pH 8, epi finalman pwoteyin lan te eliye ak 20 mM Tris-HCl, 200 mM imidazol, pH 8. Pou jenere NT2RepCT ak NTCT, dijesyon tronbin entwodui sit la (ThrCleav) ant His ak NT.Sit klivaj tronbin yo prezan tou nan His-NT-ThrCleav-2Rep (pwodwi 2Rep), His-thioredoxin-ThrCleav-NT (pwodwi NT), His-thioredoxin-ThrCleav-CT (pwodwi CT), His-Thioredoxin-ThrCleav-NT .* (pwodwi NT*), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (pwodwi NTA72R), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (pwodwi NTF1Sp), ak His-Sulphur Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (pwodwi NTMiSp).Konstriksyon yo te dijere ak tronbin (1:1000) ak dyalize lannwit lan nan 4 ° C ak 20 mM Tris-HCl, pH 8, lè l sèvi avèk yon manbràn dyaliz Spectra / Por ak yon papòt pwa molekilè nan 6-8 kDa.Apre dyaliz, solisyon an chaje sou yon kolòn Ni-NTA epi yo kolekte efluan ki gen pwoteyin enterè a.Konsantrasyon pwoteyin yo te detèmine pa mezire absòbe UV nan 280 nm lè l sèvi avèk koyefisyan disparisyon nan chak pwoteyin, eksepte pou NTF1Sp, ki te itilize tès Bradford selon pwotokòl manifakti a.Pite te detèmine pa SDS polyacrylamid (4-20%) jèl elektwoforèz ak Coomassie briyan tach ble.Pwoteyin yo te konsantre lè l sèvi avèk filtè santrifujeur (VivaSpin 20, GE Healthcare) nan 4000 xg ak yon koupe pwa molekilè 10 kDa nan sik 20 minit.
Deglase solisyon pwoteyin lan epi ak anpil atansyon pipe 150 µl nan yon flacon septum klè 1 ml (8 x 40 mm Thermo Scientific).Tib yo te bouche ak sele ak parafilm pou anpeche evaporasyon.Echantiyon yo (n = 3) yo te enkube nan 37 ° C oswa 60 ° C ak detanzantan ranvèse yo obsève jelasyon.Yo te enkube echantiyon ki pa t 'jèl pou omwen yon semèn.Diminye lyezon disulfid NTMiSp ak 10 mM DTT pou chak 10 µM pwoteyin.Pou analize jelasyon an nan kouch natirèl arenyen swa, yo te koupe Spider pon an Swedish, de glann prensipal anmpullated yo te mete nan 200 μl nan 20 mM Tris-HCl tanpon pH 8 ak koupe pou pèmèt kouch la separe de glann yo..Sa ki nan glann yo fonn nan tanpon, 50 µl pou detèminasyon pwa sèk (pa enkubasyon nan flakon louvri nan 60 °C nan pwa konstan) ak 150 µl pou jelasyon nan 37 °C.
Jeyometri / zouti pou mezire a fèt an asye pur lè l sèvi avèk yon plak paralèl ak yon dyamèt tèt 20 mm ak yon espas 0.5 mm.Chofe echantiyon an soti nan 25 °C a 45 °C epi tounen nan 25 °C nan yon pousantaj de 1 °C pou chak minit lè l sèvi avèk yon plak Peltier anba asye pur.Mezi Vibration yo te pote soti nan yon frekans nan 0.1 Hz ak nan rejyon an lineyè viscoelastic nan materyèl la nan yon souch nan 5% ak 0.5% pou echantiyon nan 100 mg / mL ak 300-500 mg / mL, respektivman.Sèvi ak yon chanm imidite koutim pou anpeche evaporasyon.Done yo te analize lè l sèvi avèk Prism 9.
Pou kolekte espèk enfrawouj (IR) nan tanperati chanm nan 800 a 3900 cm–1.Aparèy ATR la, ansanm ak chemen limyè a atravè espektwomèt la, purge ak lè sèk filtre anvan ak pandan eksperyans la.Solisyon (500 mg/mL pou misyon pou minimize pik absòpsyon dlo nan spectre yo) yo te pipete sou kristal yo, ak jèl (500 mg/mL) yo te fòme anvan mezi ak Lè sa a, transfere nan kristal yo (n = 3).1000 eskanè yo te anrejistre ak yon rezolisyon nan 2 cm-1 ak sik devwa zewo nan 2. Yo te kalkile dezyèm derive a lè l sèvi avèk OPUS (Bruker) lè l sèvi avèk yon seri atenuasyon nan nèf pwen.Spectre yo te nòmalize nan menm rejyon entegrasyon an ant 1720 ak 1580 cm-1 lè l sèvi avèk F. Menges "Spectragryph - Optical Spectroscopy Software".Nan espektroskopi ATR-IR, pwofondè pénétration yon gwo bout bwa enfrawouj nan yon echantiyon depann de nimewo ond, sa ki lakòz absòpsyon pi fò nan nimewo ond ki pi ba pase nan nimewo ond ki pi wo.Efè sa yo pa te korije pou spectre yo montre nan Fig.3 paske yo piti anpil (figi siplemantè 4).Yo te kalkile spèkt korije pou figi sa a lè l sèvi avèk lojisyèl Bruker OPUS la.
Nan prensip, yon quantification konplè nan konformasyon pwoteyin posib apre dekonvolusyon serye nan eleman yo nan pik la amid I.Sepandan, kèk obstak rive nan pratik.Bri nan spectre a ka parèt tankou (fo) pik pandan dekonvolusyon.Anplis de sa, pik la akòz koube dlo kowenside ak pozisyon nan pik la amid I epi li ka gen yon grandè menm jan an pou echantiyon ki gen yon gwo kantite dlo, tankou jèl akeuz etidye isit la.Se poutèt sa, nou pa t eseye konplètman dekonpoze pik amid I a, epi obsèvasyon nou yo ta dwe konsidere sèlman nan sipò lòt metòd tankou spèktroskopi NMR.
Solisyon 50 mg/ml NT ak His-NT2RepCT te gelled lannwit lan nan 37 ° C.Lè sa a, idwojèl la dilye ak 20 mM Tris-HCl (pH 8) nan yon konsantrasyon nan 12.5 mg / ml, byen souke ak pipette kraze jèl la.Apre sa, yo te dilye idwojèl la 10 fwa ak 20 mM Tris-HCl (pH 8), yo te aplike 5 μl echantiyon an nan yon griy kòb kwiv mete kouvwi ak formvar, epi yo te retire echantiyon depase ak papye blotting.Echantiyon yo te lave de fwa ak 5 µl dlo MilliQ epi yo tache ak 1% fòma uranyl pou 5 minit.Retire depase tach ak papye absòbe, Lè sa a, lè sèk may la.Imaging te fèt sou griy sa yo lè l sèvi avèk yon FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN opere nan 100 kV.Imaj yo te anrejistre nan x 26,500 ak x 43,000 agrandisman lè l sèvi avèk yon kamera Veleta 2k × 2k CCD (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, Almay).Pou chak echantiyon (n = 1), 10-15 imaj yo te anrejistre.ImageJ (https://imagej.nih.gov/) te itilize pou analiz imaj ak mezi dyamèt fib (n = 100, fib diferan).Prism 9 te itilize pou fè tès t ki pa pè (de-tailed).Mwayèn His-NT2RepCT ak NT fibrils yo te 11.43 (SD 2.035) ak 7.67 (SD 1.389) nm, respektivman.Entèval konfyans (95%) se -4.246 a -3.275.degre libète = 198, p <0.0001.
80 µl echantiyon likid ki gen 10 µM thioflavin T (ThT) yo te mezire an triple (n = 3) nan kondisyon estatik lè l sèvi avèk Corning 96-byen nwa anba plak anba klè (Corning Glass 3881, USA).Diferans fliyoresan yo te anrejistre lè l sèvi avèk yon filtè eksitasyon 440 nm ak yon filtè emisyon 480 nm (FLUOStar Galaxy soti nan BMG Labtech, Offenburg, Almay).Siyal ThT la pa ni satire ni etenn, paske yo te fè eksperyans ak diferan konsantrasyon ThT san yo pa chanje entansite siyal la.Ekri absorpsyon nan 360 nm pou mezi brouyar.Pou eksperyans simen, 100 mg / mL jèl yo te fòme nan 37 ° C., resuspended, epi yo itilize pou simen nan rapò molè nan 5%, 10%, ak 20%.Done yo te analize lè l sèvi avèk Prism 9.
Deglase aksyon His-NT2RepCT ak NT > 100 mg/mL sou glas epi filtre nan yon filtè 0.22 µm.Konsantrasyon yo te kalkile lè w mezire absorpsyon nan 280 nm lè l sèvi avèk Nanodrop.Nan pwi yon 96-byen nwa plak ki pa obligatwa (Corning) ak yon anba klè, echantiyon yo te dilye nan 20 mg / ml nan 20 mM Tris-HCl pH 8 ak melanje ak 5 μM ThT (konsantrasyon final), total konsantrasyon echantiyon. 50 μl volim.Echantiyon yo te imajine chak 10 minit nan 37 °C sou yon mikwoskòp CellObserver (Zeiss) ak chanèl limyè transmèt ak eksitasyon FITC ak seri filtre emisyon pou D ThT.Yo itilize yon lantiy 20x/0.4 pou D.Zen Blue (Zeiss) ak ImageJ (https://imagej.nih.gov/) yo te itilize pou analiz imaj.Jèl yo te prepare tou nan solisyon NT ak His-NT2RepCT nan yon konsantrasyon 50 mg/mL ki gen 20 mM Tris pH 8 ak 5 µM ThT epi enkubasyon nan 37 ° C pou 90 min.Moso jèl yo te transfere nan yon nouvo pi ki gen 20 mM Tris, pH 8, ak 5 μM ThT nan yon plak anba ki pa obligatwa nwa 96 byen klè.Jwenn fliyoresans vèt ak imaj jaden klere nan agrandisman 20x/0.4.ImageJ te itilize pou analiz imaj.
Solisyon NMR spectre yo te jwenn nan 310 K sou yon 600 MHz Bruker Avance Neo spectrometer ekipe ak yon QCI Quadrupole Resonance Pulsed Gradient Field Cryoprobe (HFCN).Echantiyon NMR ki gen 10 mg/mL pwoteyin omojèn ki make ak 13C, 15N, ki fonn nan 20 mM Tris-HCl (pH 8), 0.02% (w/v) NaN3, 5% DO (v/v), (n = 1) .Chanjman chimik NT2RepCT nan pH 6.7 yo te itilize pou bay pik 23 nan spectre 2D 15N-HSQC.
Ang majik k ap vire spectre solid NMR (MAS) nan 13C, 15N ki make idwojèl yo te anrejistre sou yon espektwomèt Bruker Avance III HD nan 800 MHz ekipe ak yon pwofonde 3.2 mm 13C/15N{1H} san elektwon.Tanperati echantiyon yo te kontwole lè l sèvi avèk yon kouran gaz tanperati varyab nan 277 K. De dimansyon dipol wotasyon sonorite (DARR) 76 ak radyo frekans rekoneksyon (RFDR) 77 spectre yo te akeri nan frekans MAS nan 12.5 kHz ak 20 kHz, respektivman.Polarizasyon kwa (CP) soti nan 1H a 13C te fèt lè l sèvi avèk yon ranp lineyè soti nan 60.0 a 48.0 kHz nan 1H, 61.3/71.6 kHz nan 13C (nan 12.5/20 kHz MAS) ak tan kontak 0.5-1 ms.Epinyè 6478 dekouplage nan 73.5 kHz te itilize pandan koleksyon done.Tan akizisyon an te 10 milisgond ak reta sik la te 2.5 segonn.Yon sèl-lye Cα/Cβ korelasyon yo obsève nan RFDR spectre yo te asiyen baze sou karakteristik rezidi-kalite chanjman chimik yo ak miltipliye-lye korelasyon nan spectre yo DARR.
Baz done Zipper79 la (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) te itilize pou evalye tandans flutter ak enèji Rosetta pou NT, NTFlSp, ak NTMiSp.Baz done Zipper kalkile Rosetta Energy80, ki konbine plizyè fonksyon enèji gratis pou modèl ak analize estrikti pwoteyin.Yon nivo enèji nan -23 kcal / mol oswa pi ba endike yon gwo tandans fibrile.Enèji ki pi ba a vle di plis estabilite nan de β-seksyon yo nan konfòmasyon zip la.Anplis de sa, yo te itilize algorithm Waltz pou predi rejyon amyloidogenic nan NT, NTFlSp ak NTMiSp Ref.81. (https://waltz.switchlab.org/).
Solisyon pwoteyin NT a te melanje ak tanpon 2-(N-morpholino)ethanesulfonic asid (MES) nan pH 5.5 ak 6.0 pou bese pH a pH 6 ak 7, respektivman.Konsantrasyon pwoteyin final la te 100 mg / ml.
Mezi yo te fèt sou yon espektwomèt CD J-1500 (JASCO, USA) lè l sèvi avèk yon kivèt 300 μL ak yon chemen optik 0.1 cm.Pwoteyin yo te dilye nan 10 μM (n = 1) nan 20 mM tanpon fosfat (pH 8).Pou analize estabilite pwoteyin nan prezans sèl, pwoteyin yo te analize nan menm konsantrasyon (n = 1) nan 20 mM tanpon fosfat (pH 8) ki gen 154 mM NaF oswa NaCl, respektivman.Tanperati eskanè yo te anrejistre nan 222 nm soti nan 25 ° C a 95 ° C ak yon pousantaj chofaj nan 1 ° C / min.Pwopòsyon pwoteyin ki plwaye natif natal yo te kalkile lè l sèvi avèk fòmil la (KDmeasure – KDfinal)/(KDstart – KDfinal).Anplis de sa, senk espèk yo te anrejistre pou chak echantiyon soti nan 260 nm a 190 nm nan 25 ° C ak apre chofaj a 95 ° C.Senk spectre yo te mwayèn, lis ak konvèti nan eliptik molè.Done yo te analize lè l sèvi avèk Prism 9.
Entansite fluoresans His-NT-GFP (300 mg/mL, 80 µL) te mezire an triple (n = 3) nan plak Corning 96-byen ak yon anba nwa transparan (Corning Glass 3881, USA) nan kondisyon estatik.Mezire echantiyon yo avèk yon lektè plak ki baze sou fliyoresans ak yon longèdonn eksitasyon 395 nm epi anrejistre emisyon an nan 509 nm anvan jelasyon ak 2 èdtan pita nan 37 °C.Done yo te analize ak Prism 9.
Yo te itilize twous tès aktivite purin nukleozid fosforilaz (metòd fliyometrik, Sigma Aldrich) dapre enstriksyon manifakti a.Pou mezire aktivite nan jèl ak solisyon ki genyen His-NT-PNP, melanje 10 ng His-NT-PNP ak 100 mg/mL NT pou yon volim total de 2 µL paske jèl la te bay yon siyal pi wo pase entèval deteksyon seri a.Kontwòl pou jèl ak solisyon san His-NT-PNP te enkli.Mezi yo te pote soti de fwa (n = 2).Apre yo te fin mezire aktivite a, yo te retire melanj reyaksyon an epi jèl la te foto pou asire ke jèl la rete entak pandan mezi a.Done yo te analize lè l sèvi avèk Prism 9.
Pou plis enfòmasyon sou konsepsyon etid, gade abstrè etid Nature ki lye nan atik sa a.
Figi 1 ak 2 prezante premye done yo.1c, 2a–c, 3a, b, e–g, 4, 5b, d, f, ak 6, Fig Siplemantè.3, fig siplemantè.5a, d, fig siplemantè.6 ak fig siplemantè.8. Done Done ki soti nan etid sa a òganize nan baz done Zenodo https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.Done NMR yo te jwenn nan etid sa a te afiche nan repozitwa BMRBig anba ID antre bmrbig36.Yo te pran estrikti GFP ak PNP nan PDB (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
Rising, A. ak Johansson, J. Spinning atifisyèl swa Spider.Nasyonal Chimik.byoloji.11, 309–315 (2015).
Babb, PL et al.Genomic Nephila clavipes mete aksan sou divèsite jèn swa Spider ak ekspresyon konplèks yo.Genette nasyonal.49, 895–903 (2017).