304 Nerjaveèi asye bobin tib eleman chimik, Estrikti ectodomain PACA6 a gen yon superfami konsève pwoteyin ki asosye ak fizyon gamèt.

Mèsi paske w vizite Nature.com.W ap itilize yon vèsyon navigatè ak sipò CSS limite.Pou pi bon eksperyans, nou rekòmande pou w sèvi ak yon navigatè ki ajou (oswa enfim mòd konpatibilite nan Internet Explorer).Anplis de sa, asire sipò kontinyèl, nou montre sit la san estil ak JavaScript.
Koulis ki montre twa atik pou chak glisad.Sèvi ak bouton dèyè yo ak bouton kap vini yo pou w deplase nan glisad yo, oswa bouton kontwolè glisad yo nan fen pou deplase nan chak glisad.

SPACA6 se yon pwoteyin sifas ki eksprime espèm ki enpòtan pou fizyon gamèt pandan repwodiksyon seksyèl nan mamifè.Malgre wòl fondamantal sa a, fonksyon espesifik SPAC6 a mal konprann.Nou elicide estrikti nan kristal nan domèn nan ekstraselilè nan SPACA6 nan yon rezolisyon nan 2.2 Å, revele yon pwoteyin de-domèn ki konpoze de yon pake kat-bloke ak Ig-tankou β-sandwich ansanm pa Linkers kazi-fleksib.Estrikti sa a sanble ak IZUMO1, yon lòt pwoteyin ki asosye ak fizyon gamèt, ki fè SPACA6 ak IZUMO1 manm fondatè nan superfami pwoteyin ki asosye ak fètilizasyon yo rele sa a kòm superfami IST.Sipèfami IST la defini estriktirèlman pa pake kat-helix trese li yo ak yon pè motif CXXC ki lye ak disulfid.Yon rechèch AlphaFold ki baze sou estrikti nan pwoteòm imen an te idantifye manm pwoteyin adisyonèl nan superfanmi sa a;miyò, anpil nan pwoteyin sa yo patisipe nan fizyon gamèt.Estrikti SPACA6 ak relasyon li genyen ak lòt manm superfanmi IST yo bay lyen ki manke nan konesans nou sou fizyon gamèt mamifè yo.
Chak lavi moun kòmanse ak de gamèt aploid separe: espèm papa a ak ze manman an.Espèm sa a se gayan nan yon pwosesis seleksyon entans pandan ke dè milyon de selil espèm pase nan aparèy jenital fi a, simonte divès obstak1 ak sibi kapasite, ki amelyore mobilite yo ak pwosesis la nan eleman sifas yo2,3,4.Menmsi espèm ak ovosit jwenn youn lòt, pwosesis la poko fini.Oosit la antoure pa yon kouch selil cumulus ak yon baryè glikoprotein ki rele zona pellucida, kote espèm yo dwe pase pou antre nan ovosit la.Spermatozoa sèvi ak yon konbinezon de molekil Adhesion sifas ak anzim manbràn ki asosye ak sekrete pou simonte baryè final sa yo5.Molekil sa yo ak anzim yo estoke sitou nan manbràn enteryè a ak matris akrosomal epi yo detekte lè manbràn ekstèn espèm nan lize pandan reyaksyon akrosomal la.Etap final la nan vwayaj entans sa a se evènman fizyon espèm-ze, kote de selil yo fusion manbràn yo vin tounen yon sèl òganis diploid7.Malgre ke pwosesis sa a se inogirasyon nan repwodiksyon imen, entèraksyon molekilè ki nesesè yo mal konprann.
Anplis fegondasyon gamèt yo, yo te etidye anpil chimi fizyon de kouch lipid.An jeneral, fizyon manbràn se yon pwosesis enèjikman favorab ki mande pou yon katalis pwoteyin sibi yon chanjman konformasyon estriktirèl ki pote de manbràn pi pre ansanm, kraze kontinwite yo ak sa ki lakòz fizyon8,9.Sa yo katalis pwoteyin yo konnen kòm fusogens epi yo te jwenn nan sistèm fizyon inonbrabl.Yo obligatwa pou antre viral nan selil lame yo (egzanp, gp160 nan VIH-1, pike nan coronavirus, hemaglutinin nan viris grip)10,11,12 plasenta (syncytin)13,14,15 ak fizyon gamèt ki fòme nan ekaryot ki pi ba yo ( HAP2/GCS1 nan plant, protis ak atwopod) 16,17,18,19.Fusogens pou gamèt imen yo poko dekouvri, byenke plizyè pwoteyin yo te montre yo dwe kritik pou atachman gamèt ak fizyon.CD9 ki eksprime ovosit la, yon pwoteyin transmembran ki nesesè pou fizyon sourit ak gamèt imen, se te premye moun ki te dekouvri 21,22,23.Malgre ke fonksyon egzak li rete klè, yon wòl nan adezyon, estrikti nan fokis adezyon sou ze microvilli, ak / oswa lokalizasyon ki kòrèk la nan pwoteyin sifas oosit sanble gen anpil chans 24,25,26.De pwoteyin ki pi tipik ki enpòtan pou fizyon gamèt yo se pwoteyin espèm IZUMO127 ak pwoteyin ovosit JUNO28, ak asosyasyon mityèl yo se yon etap enpòtan nan rekonesans gamèt ak adezyon anvan fizyon.Sourit knockout gason Izumo1 ak sourit knockout fi Juno yo konplètman esteril, nan modèl sa yo espèm antre nan espas perivitelin men gamèt pa fusion.Menm jan an tou, konfluans te redwi lè gamèt yo te trete ak antikò anti-IZUMO1 oswa JUNO27,29 nan eksperyans fegondasyon imen an vitro.
Dènyèman, yo te dekouvri yon gwoup ki fèk dekouvri nan espèm-eksprime pwoteyin fenotip ki sanble ak IZUMO1 ak JUNO20,30,31,32,33,34,35.Espèm akrozomal manbràn-asosye pwoteyin 6 (SPACA6) yo te idantifye kòm esansyèl pou fètilizasyon nan yon etid gwo-echèl mutajenèz murin.Ensèsyon transjèn nan nan jèn Spaca6 pwodui espèmatozoyin ki pa fuzib, byenke espèmatozoy sa yo enfiltre espas perivitelin la 36 .Etid knockout ki vin apre nan sourit konfime ke Spaca6 obligatwa pou fizyon gamèt 30,32.SPACA6 eksprime prèske sèlman nan tèstikul yo epi li gen yon modèl lokalizasyon ki sanble ak sa yo ki nan IZUMO1, sètadi nan entim nan espèmatozoyid la anvan reyaksyon akrosomal la, ak Lè sa a, imigre nan rejyon ekwatoryal la apre reyaksyon akrosomal 30,32.Omològ Spaca6 egziste nan yon varyete de mamifè ak lòt eukaryot 30 ak enpòtans li pou fizyon gamèt imen yo te demontre pa anpèchman nan fegondasyon imen an vitro pa rezistans nan SPACA6 30 .Kontrèman ak IZUMO1 ak JUNO, detay yo sou estrikti, entèraksyon, ak fonksyon nan SPACA6 rete klè.
Pou pi byen konprann pwosesis fondamantal ki kache nan fizyon espèm imen ak ze, ki pral pèmèt nou enfòme devlopman nan fiti nan planin familyal ak tretman fètilite, nou te fè syans estriktirèl ak byochimik SPANA6.Estrikti kristal nan domèn ekstraselilè nan SPACA6 montre yon pake kat-helical (4HB) ak yon domèn imunoglobulin-tankou (Ig-tankou) ki konekte pa rejyon kazi-fleksib.Jan yo te prevwa nan etid anvan yo, 7,32,37 estrikti domèn nan SPACA6 sanble ak sa yo ki nan IZUMO1 imen, ak de pwoteyin yo pataje yon motif etranj: 4HB ak yon sifas triyangilè helical ak yon pè nan disulfide-lye motif CXXC.Nou pwopoze ke IZUMO1 ak SPACA6 kounye a defini yon pi gwo, estriktirèl ki gen rapò ak superfami nan pwoteyin ki asosye ak fizyon gamèt.Sèvi ak karakteristik inik nan superfamiy la, nou te fè yon rechèch konplè pou AlphaFold estriktirèl pwoteòm imen an, idantifye lòt manm nan sipèfami sa a, ki gen ladan plizyè manm ki enplike nan fizyon gamèt ak/oswa fètilizasyon.Li kounye a parèt ke gen yon pliye estriktirèl komen ak superfami nan pwoteyin ki asosye ak fizyon gamèt, ak estrikti nou an bay yon kat molekilè nan aspè enpòtan sa a nan mekanis fizyon gamèt imen an.
SPACA6 se yon pwoteyin transmembrane yon sèl-pas ki gen yon sèl glikan N-lye ak sis lyezon disulfid (Figi S1a ak S2).Nou eksprime domèn ekstraselilè nan SPACA6 imen (résid 27-246) nan selil Drosophila S2 ak pirifye pwoteyin nan lè l sèvi avèk nikèl afinite, echanj kasyon, ak kromatografi esklizyon gwosè (Fig. S1b).Ektodomèn PACA6 pirifye a trè estab ak omojèn.Analiz ki itilize chromatografi eksklizyon gwosè konbine avèk gaye limyè poligonal (SEC-MALS) revele yon sèl pik ak yon pwa molekilè kalkile nan 26.2 ± 0.5 kDa (Fig. S1c).Sa a se ki konsistan avèk gwosè a nan ectodomain monomerik SPACA6, ki endike ke oligomerization pa t 'rive pandan pirifikasyon.Anplis de sa, sikilè dichroism (CD) espektroskopi revele yon estrikti melanje α / β ak yon pwen k ap fonn nan 51.3 °C (Fig. S1d, e).Dekonvolusyon nan spectre CD yo revele 38.6% α-helical ak 15.8% β-bloke eleman (Figi S1d).
Te ectodomain SPACA6 kristalize lè l sèvi avèk simen matris o aza38 sa ki lakòz yon seri done ak yon rezolisyon 2.2 Å (Tablo 1 ak Figi S3).Sèvi ak yon konbinezon de sibstitisyon molekilè ki baze sou fragman ak done faz SAD ak ekspoze bromur pou detèminasyon estrikti (Tablo 1 ak Figi S4), modèl final la rafine konsiste de résidus 27-246.Nan moman yo te detèmine estrikti a, pa te gen okenn estrikti eksperimantal oswa AlphaFold ki disponib.Ektodomèn SPACA6 mezire 20 Å × 20 Å × 85 Å, konsiste de sèt elis ak nèf β-seksyon, e li gen yon pliye long siperyè estabilize pa sis lyezon disulfid (Fig. 1a, b).Dansite elèktron fèb nan fen chèn bò Asn243 la endike ke rezidi sa a se yon glikozilasyon N-lye.Estrikti a konsiste de de domèn: yon pake N-tèminal kat-helix (4HB) ak yon domèn C-tèminal tankou Ig ak yon rejyon charnyèr entèmedyè ant yo (figi 1c).
yon Estrikti domèn ekstraselilè SPAC6.Dezabiye dyagram nan domèn ekstraselilè nan SPACA6, koulè chèn nan soti nan N rive nan C-tèminal soti nan ble fonse a wouj fonse.Cysteines ki enplike nan lyezon disulfid yo make nan magenta.b Topoloji domèn ekstraselilè SPAC6.Sèvi ak koulè menm jan ak Figi 1a.c SPANCA6 domèn ekstraselilè.Tablo teren 4HB, charnyèr, ak domèn tankou Ig yo gen koulè zoranj, vèt, ak ble, respektivman.Kouch yo pa trase nan echèl.
Domèn 4HB nan SPACA6 gen ladan kat elis prensipal (helis 1-4), ki ranje nan fòm lan nan yon helix helix (figi 2a), altène ant entèraksyon antiparalèl ak paralèl (figi 2b).Yon ti helix yon sèl vire adisyonèl (helix 1′) mete pèpandikilè ak pake a, fòme yon triyang ak elis 1 ak 2. Triyang sa a se yon ti kras defòme nan anbalaj la hélicoïdal trese nan anbalaj la relativman dans nan elis 3 ak 4 ( Fig. 2a).
Tablo teren 4HB N-tèminal.b View anlè yon pakèt kat elis, chak elis make an ble fonse nan N-tèminal la ak wouj fonse nan C-tèminal la.c Dyagram wou espiral anwo-desann pou 4HB, ak chak rezidi yo montre kòm yon sèk ki make ak yon kòd asid amine ki gen yon sèl lèt;se sèlman kat asid amine ki nan tèt wou a ki konte.Résidus ki pa polè yo gen koulè jòn, résidus polè ki pa chaje yo gen koulè vèt, résidus ki chaje pozitivman yo gen koulè ble, ak résidus ki chaje negatif yo gen koulè wouj.d Fas triyangilè nan domèn 4HB a, ak 4HBs an zoranj ak gon an vèt.Tou de ensèk yo montre lyezon disulfid ki gen fòm baton.
4HB konsantre sou yon nwayo idrofob enteryè ki konpoze sitou nan résidus alifatik ak aromat (figi 2c).Nwayo a gen yon kosyon disulfid ant Cys41 ak Cys55 ki lye elis 1 ak 2 ansanm nan yon triyang anwo leve (figi 2d).De lyezon disulfid adisyonèl yo te fòme ant motif CXXC nan Helix 1′ ak yon lòt motif CXXC yo te jwenn nan pwent β-epingl nan rejyon an charnyèr (Fig. 2d).Yon rezidi arjinin konsèvatif ak yon fonksyon enkoni (Arg37) sitiye andedan yon triyang kre ki te fòme pa elis 1′, 1, ak 2. Atòm kabòn alifatik Cβ, Cγ, ak Cδ Arg37 kominike avèk nwayo idrofob la, ak gwoup guanidine li yo deplase siklik. ant elis 1′ ak 1 atravè entèraksyon ant zo rèl do Thr32 ak chèn bò (figi S5a, b).Tyr34 pwolonje nan kavite a kite de ti kavite nan ki Arg37 ka kominike avèk sòlvan an.
Domèn β-sandwich ki tankou Ig yo se yon gwo superfami pwoteyin ki pataje karakteristik komen de oswa plis β-fèy anfipatik milti-cheche ki kominike atravè yon nwayo idrofob 39. Domèn ki tankou Ig C-terminal nan SPACA6 gen menm modèl la. epi li konsiste de de kouch (Fig. S6a).Fèy 1 se yon β-fèy ki gen kat seksyon (seksyon D, F, H, ak I) kote seksyon F, H, ak I fòme yon aranjman anti-paralèl, ak seksyon I ak D pran yon entèraksyon paralèl.Tablo 2 se yon ti fèy beta anti-paralèl doub-chèn (seksyon E ak G).Yo te obsève yon kosyon disulfid entèn ant tèminal C nan chèn E ak sant chèn H (Cys170-Cys226) (Fig. S6b).Kosyon disulfid sa a se analogue ak kosyon disulfide nan domèn β-sandwich nan imunoglobulin40,41.
β-fèy kat-seksyon an tòde sou tout longè li yo, fòme kwen asimetri ki diferan nan fòm ak elektwostatik.Kwen ki pi mens se yon sifas ki plat idrofob anviwònman an ki kanpe deyò konpare ak sifas ki rete inegal ak elektwostatik divès nan SPACA6 (Fig. S6b, c).Yon halo ki ekspoze nan zo rèl do kabònil/amino gwoup ak chenn bò polè antoure sifas idrofob la (figi S6c).Marge ki pi laj la kouvri pa yon segman hélicoïdal bouchon ki bloke pòsyon N-tèminal nwayo idrofob la epi ki fòme twa lyezon idwojèn ak gwoup polè louvri zo rèl F chèn lan (Fig. S6d).Pòsyon C-tèminal kwen sa a fòme yon gwo pòch ak yon nwayo idrofob ki pasyèlman ekspoze.Pòch la antoure pa chaj pozitif akòz twa seri rezidi doub arjinin (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 ak Arg212-Arg214) ak yon histidine santral (His220) (Figi S6e).
Rejyon charnyèr la se yon segman kout ant domèn hélicoïdal ak domèn tankou Ig, ki gen ladann yon sèl antiparalèl twa-chachen β-kouch (seksyon A, B ak C), yon ti helix 310, ak plizyè long segman hélicoïdal o aza.(Fig. S7).Yon rezo nan kontak kovalan ak elektwostatik nan rejyon an charnyèr parèt estabilize oryantasyon ki genyen ant 4HB ak domèn nan tankou Ig.Ka rezo a ap divize an twa pati.Premye pati a gen ladan de motif CXXC (27CXXC30 ak 139CXXC142) ki fòme yon pè lyezon disulfid ant β-epingl nan gon an ak 1' helix la nan 4HB.Dezyèm pati a gen ladan entèraksyon elektwostatik ant domèn nan tankou Ig ak charnyèr la.Glu132 nan charnyèr la fòme yon pon sèl ak Arg233 nan domèn nan tankou Ig ak Arg135 nan charnyèr la.Twazyèm pati a gen ladan yon lyen kovalan ant domèn tankou Ig ak rejyon gon.De lyezon disulfide (Cys124-Cys147 ak Cys128-Cys153) konekte bouk charnyèr la nan yon linker ki estabilize pa entèraksyon elektwostatik ant Gln131 ak gwoup fonksyonèl zo rèl do a, ki pèmèt aksè nan premye domèn nan tankou Ig.chèn.
Estrikti ectodomain SPACA6 ak estrikti endividyèl 4HB ak domèn tankou Ig yo te itilize pou fè rechèch pou dosye estriktirèl ki sanble nan baz done pwoteyin 42 .Nou te idantifye alimèt ak gwo nòt Dali Z, ti devyasyon estanda, ak gwo nòt LALI (dènye a se kantite rezidi estriktirèl ekivalan).Pandan ke 10 premye frape yo soti nan rechèch la ectodomain konplè (Tablo S1) te gen yon Z-sò akseptab nan> 842, yon rechèch pou 4HB oswa domèn Ig-like pou kont li te montre ke pi fò nan frape sa yo koresponn ak β-sandwich sèlman.yon pli omniprésente jwenn nan anpil pwoteyin.Tout twa rechèch nan Dali te retounen yon sèl rezilta: IZUMO1.
Li te sigjere depi lontan ke SPACA6 ak IZUMO1 pataje resanblans estriktirèl7,32,37.Malgre ke ectodomains de pwoteyin ki asosye ak fizyon gamèt sa yo pataje sèlman 21% idantite sekans (Figi S8a), prèv konplèks, ki gen ladan yon modèl lyezon disulfid konsève ak yon domèn prevwa ki sanble ak C-terminal Ig nan SPACA6, te pèmèt tantativ bonè yo bati yon modèl omoloji nan A yon sourit PACA6 lè l sèvi avèk IZUMO1 kòm yon modèl37.Estrikti nou an konfime prediksyon sa yo epi montre vre degre resanblans la.An reyalite, estrikti SPACA6 ak IZUMO137,43,44 pataje menm achitekti de domèn (Fig. S8b) ak domèn β-sandwich ki sanble 4HB ak Ig ki konekte pa yon rejyon gon (Fig. S8c).
IZUMO1 ak SPACA6 4HB gen diferans komen nan pake espiral konvansyonèl yo.4HBs tipik, tankou sa yo jwenn nan konplèks pwoteyin SNARE ki enplike nan fizyon endozomal 45,46, gen elis ki egalman espacement kenbe yon koub konstan alantou yon aks santral 47. Kontrèman, domèn yo helikal nan tou de IZUMO1 ak SPACA6 te defòme, ak koub varyab ak anbalaj inegal (Figi S8d).Tòde a, pwobableman ki te koze pa triyang ki te fòme pa elis 1′, 1 ak 2, kenbe nan IZUMO1 ak SPACA6 epi estabilize pa menm motif CXXC sou elis 1′.Sepandan, kosyon disulfid adisyonèl yo te jwenn nan SPACA6 (Cys41 ak Cys55 kovalan ki lye elis 1 ak 2 pi wo a) kreye yon pi byen file nan tèt triyang lan, ki fè SPACA6 plis trese pase IZUMO1, ak triyang kavite pi pwononse.Anplis de sa, IZUMO1 manke Arg37 obsève nan sant la nan kavite sa a nan SPACA6.Kontrèman, IZUMO1 gen yon nwayo idrofob pi tipik nan résidus alifatik ak aromat.
IZUMO1 gen yon domèn tankou Ig ki gen ladann yon β-fèy doub-bloke ak senk-bloke43.Strand siplemantè a nan IZUMO1 ranplase bobin nan SPACA6, ki reyaji ak strand F la pou limite lyezon idwojèn zo rèl nan strand la.Yon pwen enteresan nan konparezon se chaj sifas prevwa nan domèn yo tankou Ig nan de pwoteyin yo.Sifas IZUMO1 a chaje plis negatif pase sifas SPACA6.Yon chaj adisyonèl sitiye tou pre C-tèminal la fè fas a manbràn espèm la.Nan SPACA6, menm rejyon yo te plis net oswa pozitivman chaje (Fig. S8e).Pou egzanp, sifas idrofob la (bò mens) ak twou pozitivman chaje (bò pi laj) nan SPACA6 yo chaje negatif nan IZUMO1.
Malgre ke relasyon ak eleman estrikti segondè ant IZUMO1 ak SPACA6 byen konsève, aliyman estriktirèl domèn yo tankou Ig te montre ke de domèn yo diferan nan oryantasyon jeneral yo youn ak lòt (Fig. S9).Pake espiral IZUMO1 koube sou β-sandwich la, kreye fòm "boomerang" ki te dekri deja nan apeprè 50 ° soti nan aks santral la.Kontrèman, gwo bout bwa a hélicoïdal nan SPACA6 te panche sou 10 ° nan direksyon opoze a.Diferans ki genyen nan oryantasyon sa yo gen anpil chans akòz diferans ki genyen nan rejyon an charnyèr.Nan nivo sekans prensipal la, IZUMO1 ak SPACA6 pataje ti resanblans sekans nan charnyèr la, ak eksepsyon de sistein, glisin, ak rezidi asid aspartik.Kòm yon rezilta, lyezon idwojèn ak rezo elektwostatik yo konplètman diferan.β-fèy eleman estrikti segondè yo pataje pa IZUMO1 ak SPACA6, byenke chenn yo nan IZUMO1 yo pi long ak helix 310 la (helix 5) se inik nan SPACA6.Diferans sa yo lakòz diferan oryantasyon domèn pou de pwoteyin otreman menm jan an.
Rechèch sèvè Dali nou an te revele ke SPACA6 ak IZUMO1 se sèlman de estrikti eksperimantal detèmine ki estoke nan baz done pwoteyin ki gen pliye 4HB patikilye sa a (Tablo S1).Plis dènyèman, DeepMind (Alphabet/Google) te devlope AlphaFold, yon sistèm ki baze sou rezo neral ki ka prevwa avèk presizyon estrikti 3D nan pwoteyin ki soti nan sekans prensipal48.Yon ti tan apre nou fin rezoud estrikti PACA6 la, baz done AlphaFold la te pibliye, bay modèl estrikti prediksyon ki kouvri 98.5% nan tout pwoteyin nan proteome imen an48,49.Sèvi ak estrikti SPACA6 rezoud nou an kòm yon modèl rechèch, yon rechèch omoloji estriktirèl pou modèl la nan AlphaFold pwoteòm imen an te idantifye kandida ki gen posiblite resanblans estriktirèl ak SPACA6 ak IZUMO1.Bay presizyon nan enkwayab nan AlphaFold nan predi SPACA6 (Fig. S10a)-espesyalman 1.1 Å rms ectodomain a konpare ak estrikti rezoud nou an (Fig. S10b) - nou ka gen konfyans ke alimèt SPACA6 yo idantifye yo gen anpil chans yo dwe egzat.
Anvan sa, PSI-BLAST te chèche gwoup IZUMO1 ak twa lòt pwoteyin ki asosye ak espèm: IZUMO2, IZUMO3, ak IZUMO450.AlphaFold te prevwa ke pwoteyin fanmi IZUMO sa yo pliye nan domèn 4HB ak menm modèl kosyon disulfid la kòm IZUMO1 (Figi 3a ak S11), byenke yo manke yon domèn tankou Ig.Li se ipotèz ke IZUMO2 ak IZUMO3 se yon sèl-side pwoteyin manbràn ki sanble ak IZUMO1, pandan y ap IZUMO4 parèt yo dwe sekrete.Fonksyon pwoteyin IZUMO 2, 3, ak 4 nan fizyon gamèt pa te detèmine.Yo konnen IZUMO3 jwe yon wòl nan byogenesis akwosòm pandan devlopman espèm51 e yo jwenn pwoteyin IZUMO pou fòme yon konplèks50.Konsèvasyon pwoteyin IZUMO nan mamifè, reptil, ak anfibyen sijere ke fonksyon potansyèl yo konsistan avèk lòt pwoteyin ki asosye ak fizyon gamèt yo, tankou DCST1/2, SOF1, ak FIMP.
Dyagram nan achitekti domèn nan superfami IST, ak 4HB, gon, ak domèn tankou Ig make an zoranj, vèt, ak ble, respektivman.IZUMO4 gen yon rejyon inik C-tèminal ki sanble nwa.Konfime ak lyezon disulfid yo montre pa liy solid ak pwentiye, respektivman.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F1), ak AlphaTMEM95 DB: AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) yo parèt nan menm seri koulè ak panèl A. Obligasyon disulfid yo montre nan magenta.Elis transmembrane TMEM95, IZUMO2 ak IZUMO3 yo pa montre.
Kontrèman ak pwoteyin IZUMO a, lòt pwoteyin SPACA (sa vle di, SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5, ak SPACA9) yo panse yo dwe estriktirèl diferan de SPACA6 (Fig. S12).SPACA9 sèlman gen 4HB, men li pa espere gen menm oryantasyon paralèl-anti-paralèl oswa menm kosyon disulfid la kòm SPACA6.SPACA1 sèlman gen yon domèn ki sanble ak Ig.AlphaFold predi ke SPACA3, SPACA4 ak SPACA5 gen yon estrikti konplètman diferan pase SPACA6.Enteresan, se SPACA4 li te ye tou pou jwe yon wòl nan fètilizasyon, men nan yon pi gwo limit pase SPACA6, olye pou fasilite entèraksyon ki genyen ant espèm ak oosit zòn pellucida52.
Rechèch AlphaFold nou an te jwenn yon lòt match pou IZUMO1 ak SPACA6 4HB, TMEM95.TMEM95, yon sèl pwoteyin transmembrane espèm-espèsifik, rann sourit gason pa fètil lè yo retire 32,33.Spèmatozoa ki manke TMEM95 te gen mòfoloji nòmal, mobilite, ak kapasite nan antre nan zòn pellucida a ak mare nan manbràn ze a, men yo pa t 'kapab fusion ak manbràn nan oosit.Etid anvan yo te montre ke TMEM95 pataje resanblans estriktirèl ak IZUMO133.Vreman vre, modèl AlphaFold konfime ke TMEM95 se yon 4HB ak menm pè a nan motif CXXC kòm IZUMO1 ak SPACA6 ak menm kosyon an disulfide adisyonèl ant elis 1 ak 2 yo te jwenn nan SPACA6 (Fig. 3a ak S11).Malgre ke TMEM95 manke yon domèn tankou Ig, li gen yon rejyon ki gen yon modèl kosyon disulfide ki sanble ak rejyon gon SPACA6 ak IZUMO1 (Fig. 3b).Nan moman piblikasyon maniskri sa a, sèvè preprint la rapòte estrikti TMEM95 la, ki konfime rezilta AlphaFold53 la.TMEM95 sanble anpil ak SPACA6 ak IZUMO1 epi li deja konsève evolisyonèman nan anfibyen (Fig. 4 ak S13).
Rechèch PSI-BLAST la te itilize baz done NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP, ak SOF1 pou detèmine pozisyon sekans sa yo nan pye bwa lavi a.Distans ant pwen branch yo pa montre nan echèl.
Resanblans estriktirèl enpresyonan ant SPACA6 ak IZUMO1 sijere ke yo se manm fondatè yon superfamiy estriktirèl konsève ki gen ladan pwoteyin TMEM95 ak IZUMO 2, 3, ak 4.manm li te ye: IZUMO1, SPACA6 ak TMEM95.Paske se sèlman kèk manm ki genyen domèn ki sanble ak Ig, mak sipèfanmi IST la se domèn 4HB a, ki gen karakteristik inik ki komen nan tout pwoteyin sa yo: 1) 4HB anwoule ak elis ki ranje nan yon altènasyon anti-paralèl/paralèl (Fig. . 5a), 2) pake a gen yon figi triyangilè ki gen de elis nan pake a ak yon twazyèm elis vètikal (Fig. zòn kle (Fig. 5c). Motif CXXC la, yo jwenn nan pwoteyin ki sanble ak tioredoksin, li te ye pou fonksyone. kòm yon Capteur redox 54,55,56, pandan y ap motif nan manm fanmi IST yo ka asosye ak izomeraz disulfid pwoteyin tankou ERp57 nan fizyon gamèt.Wòl yo asosye 57,58.
Manm superfamiy IST yo defini pa twa karakteristik domèn 4HB a: kat elis altène ant oryantasyon paralèl ak antiparalèl, fas ba-triyangilè helical pake, ak yon motif doub ca CXXC ki fòme ant ti molekil.) Helix N-tèminal (zoranj) ak rejyon gon β-epingl (vèt).
Bay resanblans ki genyen ant SPACA6 ak IZUMO1, yo te teste kapasite ansyen an pou mare ak IZUMO1 oswa JUNO.Biolayer interferometry (BLI) se yon metòd obligatwa ki baze sou sinetik ki te deja itilize pou quantifier entèraksyon ki genyen ant IZUMO1 ak JUNO.Apre enkubasyon detèktè biotin ki make ak IZUMO1 kòm yon Garnier ak yon gwo konsantrasyon nan JUNO analit, yo te detekte yon siyal fò (Fig. S14a), ki endike yon chanjman obligatwa-induit nan epesè nan biomateryèl la tache ak pwent nan Capteur.Siyal menm jan an (sa vle di, JUNO makonnen ak Capteur a kòm yon Garnier kont IZUMO1 analit) (Fig. S14b).Pa gen okenn siyal yo te detekte lè yo te itilize SPACA6 kòm yon analit kont Capteur-bound IZUMO1 oswa Capteur-bound JUNO (Figi S14a, b).Absans siyal sa a endike ke domèn ekstraselilè nan SPACA6 pa kominike avèk domèn ekstraselilè IZUMO1 oswa JUNO.
Paske tès BLI a baze sou biotinylation résidus lizin gratis sou pwoteyin Garnier, modifikasyon sa a ka anpeche obligatwa si rezidi lizin yo patisipe nan entèraksyon an.Anplis de sa, oryantasyon an nan obligatwa a relatif nan Capteur a ka kreye antrav esterik, se konsa konvansyonèl analiz rale-desann yo te fèt tou sou recombinant SPACA6, IZUMO1 ak JUNO ectodomains.Malgre sa, SPACA6 pa t presipite ak His-tagged IZUMO1 oswa His-tagged JUNO (Fig. S14c, d), ki endike pa gen okenn entèraksyon ki konsistan avèk sa yo obsève nan eksperyans BLI.Kòm yon kontwòl pozitif, nou konfime entèraksyon an nan JUNO ak ki make li IZUMO1 (Figi S14e ak S15).
Malgre resanblans estriktirèl ant SPACA6 ak IZUMO1, enkapasite SPACA6 pou mare JUNO pa etone.Sifas imen IZUMO1 gen plis pase 20 résidus ki kominike avèk JUNO, ki gen ladan résidus ki soti nan chak nan twa rejyon yo (byenke pifò nan yo sitiye nan rejyon an charnyèr) (Fig. S14f).Nan résidus sa yo, se sèlman youn ki konsève nan SPACA6 (Glu70).Pandan ke anpil sibstitisyon rezidi kenbe pwopriyete orijinal byochimik yo, rezidi esansyèl Arg160 nan IZUMO1 te ranplase pa Asp148 ki chaje negatif nan SPACA6;syans anvan yo te montre ke mitasyon Arg160Glu nan IZUMO1 prèske konplètman aboli obligatwa nan JUNO43.Anplis de sa, diferans ki genyen nan oryantasyon domèn ant IZUMO1 ak SPACA6 siyifikativman ogmante sifas la nan sit la JUNO-obligatwa nan rejyon an ekivalan sou SPACA6 (figi S14g).
Malgre bezwen li te ye pou SPACA6 pou fizyon gamèt ak resanblans li yo ak IZUMO1, SPACA6 pa sanble gen yon fonksyon obligatwa JUNO ekivalan.Se poutèt sa, nou te chèche konbine done estriktirèl nou yo ak prèv enpòtans yo bay pa byoloji evolisyonè.Sekans aliyman nan omològ PACA6 montre konsèvasyon estrikti komen an pi lwen pase mamifè yo.Pou egzanp, rezidi sistein yo prezan menm nan anfibyen byen lwen ki gen rapò (figi 6a).Sèvi ak sèvè ConSurf la, done retansyon aliyman sekans miltip nan 66 sekans yo te trase sou sifas SPACA6 la.Kalite analiz sa a ka montre ki rezidi yo te konsève pandan evolisyon pwoteyin epi yo ka endike ki rejyon sifas jwe yon wòl nan fonksyon.
yon Sekans aliyman ectodomains PACA6 ki soti nan 12 espès diferan ki prepare avèk CLUSTAL OMEGA.Dapre analiz ConSurf, pozisyon ki pi konsèvatif yo make an ble.Résidus Cysteine ​​yo make an wouj.Fwontyè domèn ak eleman estrikti segondè yo montre nan tèt aliyman an, kote flèch yo endike β-seksyon ak vag yo endike elis.Idantifyan Aksè NCBI ki genyen sekans yo se: moun (Homo sapiens, NP_001303901), mandrill (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), makak kapucin (Cebus mimic, XP_017359366), chwal (Equus caballus), killer 202350235, XP_0610235 XP_032_034) .), mouton (Ovis aries, XP_014955560), elefan (Loxodonta africana, XP_010585293), chen (Canis lupus familyis, XP_025277208), sourit (Mus musculus, NP_001156381), Tasmanian devil (Sar11, XP_03), XP_03 8) , 61_89 ak Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113).Nimero a baze sou lòd moun.b Reprezantasyon sifas nan estrikti SPACA6 ak 4HB nan tèt la ak domèn tankou Ig nan pati anba a, koulè ki baze sou estimasyon konsèvasyon nan sèvè ConSurf la.Pati ki pi byen konsève yo se an ble, pati ki pi byen konsève yo an blan, epi ki pi piti yo se an jòn.sistein koulè wouj violèt.Twa plak sifas ki demontre yon wo nivo de pwoteksyon yo montre nan plak yo ki make 1, 2 ak 3. Yo montre yon desen 4HB nan ensèk la nan tèt dwat (menm konplo koulè).
Estrikti PACA6 a gen twa rejyon sifas ki trè konsève (figi 6b).Patch 1 spans 4HB ak rejyon an charnyèr epi li gen de konsève CXXC disulfide pon, yon rezo charnyèr Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 (Fig. S7), ak twa konsève rezidi ekstèn aromat (Phe31, Tyr73, Phe137)).yon Rim pi laj nan domèn nan tankou Ig (Fig. S6e), ki reprezante plizyè résidus chaje pozitivman sou sifas la espèm.Enteresan, plak sa a gen yon epitop antikò ki te deja montre entèfere ak fonksyon SPACA6 30.Rejyon 3 kouvri gon ak yon bò nan domèn tankou Ig la;rejyon sa a gen prolin konsève (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) ak rezidi polè/chaje ki fè fas a deyò.Surprenante, pi fò nan résidus yo sou sifas 4HB yo trè varyab (figi 6b), byenke pliye a konsève nan tout omològ SPACA6 la (jan sa endike nan konsèvatis nan nwayo a pake idrofob) ak pi lwen pase superfamiy IST la.
Malgre ke sa a se rejyon ki pi piti a nan SPACA6 ak mwens eleman detekte estrikti segondè yo, anpil rès rejyon charnyèr (ki gen ladan rejyon 3) yo trè konsève nan mitan omològ SPACA6, ki ka endike ke oryantasyon an nan pake a helical ak β-sandwich jwe yon wòl.kòm yon konsèvatif.Sepandan, malgre lyezon idwojèn vaste ak rezo elektwostatik nan rejyon an charnyèr nan SPACA6 ak IZUMO1, prèv fleksibilite intrinsèques ka wè nan aliyman an nan estrikti yo pèmèt miltip nan IZUMO137,43,44.Aliyman nan domèn endividyèl yo sipèpoze byen, men oryantasyon nan domèn yo parapò youn ak lòt varye ant 50 ° ak 70 ° soti nan aks santral la (Fig. S16).Pou konprann dinamik konformasyon SPACA6 nan solisyon, yo te fè eksperyans SAXS (Fig. S17a, b).Ab initio rekonstriksyon ectodomain SPACA6 konfòm ak yon estrikti kristal baton (Fig. S18), byenke trase Kratky la te montre kèk degre nan fleksibilite (Fig. S17b).Konfòmasyon sa a diferansye ak IZUMO1, kote pwoteyin ki pa lye a pran yon fòm boomerang tou de nan lasi a ak nan solisyon43.
Pou idantifye espesifikman rejyon fleksib la, yo te fè espektroskopi mas echanj idwojèn-deteryòm (H-DXMS) sou SPACA6 epi konpare ak done yo te deja jwenn sou IZUMO143 (Fig. 7a, b).SPACA6 se klèman pi fleksib pase IZUMO1, jan sa pwouve pa echanj deteryòm ki pi wo nan tout estrikti a apre 100,000 s nan echanj.Nan tou de estrikti, pati C-tèminal nan rejyon an charnyèr montre yon wo nivo de echanj, ki pwobableman pèmèt wotasyon limite nan domèn 4HB ak Ig-tankou parapò youn ak lòt.Enteresan, pati nan C-tèminal nan charnyèr SPACA6 a, ki gen ladan rezidi 147CDLPLDCP154 la, se yon rejyon trè konsève 3 (figi 6b), pètèt ki endike ke fleksibilite interdomain se yon karakteristik evolisyonè konsève nan SPACA6.Dapre analiz fleksibilite a, CD tèmik fonn done te montre ke SPACA6 (Tm = 51.2 ° C) se mwens ki estab pase IZUMO1 (Tm = 62.9 ° C) (Fig. S1e ak S19).
a H-DXMS imaj SPACA6 ak b IZUMO1.Pousantaj deteryòm echanj la te detèmine nan pwen tan ki endike yo.Nivo echanj idwojèn-deteryòm yo endike pa koulè sou yon echèl gradyan soti nan ble (10%) a wouj (90%).Bwat nwa reprezante zòn nan gwo echanj.Limit yo nan 4HB, charnyèr ak domèn tankou Ig obsève nan estrikti kristal la yo montre pi wo a sekans prensipal la.Nivo echanj Deteryòm nan 10 s, 1000 s, ak 100,000 s yo te trase sou yon tablo teren sipèpoze sou sifas molekilè transparan SPACA6 ak IZUMO1.Pati nan estrikti ki gen yon nivo echanj deteryòm ki pi ba pase 50% gen koulè blan.Zòn ki pi wo a 50% echanj H-DXMS yo gen koulè nan yon echèl gradyan.
Itilizasyon CRISPR/Cas9 ak estrateji jenetik knockout jèn sourit te mennen nan idantifikasyon plizyè faktè enpòtan pou espèm ak ze obligatwa ak fizyon.Apa de entèraksyon ki byen karakterize nan estrikti IZUMO1-JUNO ak CD9, pi fò nan pwoteyin ki asosye ak fizyon gamèt yo rete estriktirèl ak fonksyonèl enigmatik.Karakterizasyon byofizik ak estriktirèl SPACA6 se yon lòt moso nan devinèt molekilè adezyon / fizyon an pandan fètilizasyon.
SPACA6 ak lòt manm superfanmi IST yo parèt byen konsève nan mamifè yo ansanm ak zwazo endividyèl, reptil, ak anfibyen;an reyalite, yo panse ke SPACA6 menm obligatwa pou fètilizasyon nan pwason zèb 59. Distribisyon sa a sanble ak lòt pwoteyin ki asosye ak fizyon gamèt li te ye tankou DCST134, DCST234, FIMP31, ak SOF132, ki sijere ke faktè sa yo se HAP2-defisi (tou ke yo rekonèt kòm GCS1) pwoteyin ki responsab aktivite katalitik anpil protis., plant, ak atwopod.Pwoteyin fizyon fètilize 60, 61. Malgre gwo resanblans estriktirèl ant SPACA6 ak IZUMO1, knockout nan jèn ki kode youn nan pwoteyin sa yo te lakòz lakòz nan sourit gason, ki endike ke fonksyon yo nan fizyon gamèt yo pa kopi..Plis an jeneral, pa youn nan pwoteyin espèm yo konnen ki nesesè pou faz adezyon fizyon an se redondants.
Li rete yon kesyon ouvè si SPACA6 (ak lòt manm nan superfami IST) patisipe nan junctions intergametic, fòme rezo intragametic pou rekrite pwoteyin enpòtan nan pwen fizyon, oswa petèt menm aji kòm fuzogens flotant.Etid ko-iminopresipasyon nan selil HEK293T te revele yon entèraksyon ant tout longè IZUMO1 ak SPACA632.Sepandan, ectodomains recombinant nou yo pa t 'kominike nan vitro, sijere ke entèraksyon yo wè nan Noda et al.tou de te efase nan konstwi a (nòt ke sitoplasmik IZUMO1, ki te montre yo pa nesesè pou fètilizasyon62).Altènativman, IZUMO1 ak/oswa SPACA6 ka mande pou anviwònman obligatwa espesifik ke nou pa repwodui nan vitro, tankou konformasyon fizyolojik espesifik oswa konplèks molekilè ki gen lòt pwoteyin (li te ye oswa poko dekouvri).Byenke yo kwè ectodomain IZUMO1 la medyatè atachman espèmatozoyis ak ze nan espas perivitellin la, objektif ectodomain SPACA6 pa klè.
Estrikti nan SPACA6 revele plizyè sifas konsève ki ka patisipe nan entèraksyon pwoteyin-pwoteyin.Pati ki konsève nan rejyon an charnyèr imedyatman adjasan a motif CXXC (deziyen Patch 1 pi wo a) gen plizyè résidus aromat ki fè fas a deyò ki souvan asosye ak entèraksyon idrofob ak π-pile ant biomolekil.Kote yo laj nan domèn nan tankou Ig (rejyon 2) fòme yon Groove pozitivman chaje ak trè konsève Arg ak résidus Li yo, ak antikò kont rejyon sa a te deja itilize yo bloke fizyon gamèt 30 .Antikò a rekonèt epitop lineyè 212RIRPAQLTHRGTFS225, ki gen twa nan sis résidus arjinin ak His220 trè konsève.Li pa klè si malfonksyònman an se akòz blokaj nan résidus espesifik sa yo oswa tout rejyon an.Kote espas sa a toupre C-tèminal β-sandwich la endike entèraksyon cis ak pwoteyin espèm vwazen, men se pa ak pwoteyin ovosit.Anplis de sa, retansyon an nan yon mele ki gen anpil fleksib pwolin (sit 3) nan charnyèr la ka sit la nan yon entèraksyon pwoteyin-pwoteyin oswa, plis chans, endike retansyon nan fleksibilite ant de domèn yo.Sèks enpòtan pou wòl enkoni nan SPACA6.fizyon gamèt.
SPACA6 gen pwopriyete pwoteyin adezyon entèselilè, ki gen ladan Ig-tankou β-sandwich.Anpil pwoteyin adezif (egzanp, kadherin, entegrin, adhesin, ak IZUMO1) posede youn oswa plis domèn β-sandwich ki pwolonje pwoteyin soti nan manbràn selilè a nan objektif anviwònman yo63,64,65.Domèn Ig-tankou SPACA6 genyen tou yon motif ki souvan jwenn nan β-sandwich nan adezyon ak jwenti: doubt nan fil paralèl nan pwent yo nan β-sandwich, ke yo rekonèt kòm kranpon mekanik66.Yo kwè ke motif sa a ogmante rezistans nan fòs taye, ki gen anpil valè pou pwoteyin ki enplike nan entèraksyon entèselilè.Sepandan, malgre resanblans sa a ak adhesin, kounye a pa gen okenn prèv ki montre SPACA6 reyaji ak blan ze.Ektodomèn SPACA6 a pa kapab mare nan JUNO, ak selil HEK293T ki eksprime SPACA6, jan yo montre la a, diman kominike avèk ovosit ki manke zòn 32.Si PACA6 etabli lyezon entègametik, entèraksyon sa yo ka mande pou modifikasyon apre tradiksyon oswa estabilize pa lòt pwoteyin espèm.Nan sipò lèt ipotèz la, espèmatozoid IZUMO1-defisyan mare nan ovosit, ki demontre ke molekil ki pa IZUMO1 yo patisipe nan etap adezyon gamèt 27 la.
Anpil pwoteyin fizyon viral, selilè ak devlopman gen pwopriyete ki predi fonksyon yo kòm fusogens.Pou egzanp, glikoprotein fizyon viral (klas I, II ak III) gen yon peptide fizyon idrofob oswa bouk nan fen pwoteyin ki antre nan manbràn lame a.Kat jeyografik idrofil IZUMO143 ak estrikti (detèmine ak prevwa) superfami IST la pa montre okenn peptide fizyon idrofob aparan.Kidonk, si nenpòt pwoteyin nan superfamiy IST fonksyone kòm fuzogen, yo fè sa nan yon fason diferan de lòt egzanp li te ye.
An konklizyon, fonksyon manm yo nan superfami IST nan pwoteyin ki asosye ak fizyon gamèt rete yon mistè tantalizing.Molekil recombinant karakterize SPACA6 nou an ak estrikti rezoud li yo pral bay insight sou relasyon ki genyen ant estrikti sa yo pataje ak wòl yo nan atachman gamèt ak fizyon.
Sekans ADN ki koresponn ak ectodomain SPACA6 imen prevwa a (nimewo asansyon NCBI NP_001303901.1; résidus 27-246) te optimize kodon pou ekspresyon nan selil Drosophila melanogaster S2 ak sentèz kòm yon fragman jèn ak sekans ki kode Kozak (Eurofin)., siyal la sekresyon BiP ak korespondan 5 'ak 3' bout pou klonaj ligasyon-endepandan jèn sa a nan yon vektè ekspresyon pMT ki baze sou yon pwomotè metallothionein modifye pou seleksyon ak puromicin (pMT-puro).Vektè pMT-puro a kode yon sit klivaj tronbin ki te swiv pa yon tag 10x-Li C-tèminal (Figi S2).
Transfeksyon ki estab nan vektè SPACA6 pMT-puro nan selil D. melanogaster S2 (Gibco) te fèt menm jan ak pwotokòl yo itilize pou IZUMO1 ak JUNO43.Selil S2 yo te dekonjle ak grandi nan mwayen Schneider a (Gibco) complétée ak yon konsantrasyon final 10% (v / v) serom ti towo bèf fetal chalè-inaktive (Gibco) ak 1X antibyotik antimycotic (Gibco).Selil pasaj bonè (3.0 x 106 selil) yo te plake nan pwi endividyèl nan plak 6-byen (Corning).Apre 24 èdtan nan enkubasyon nan 27 ° C, selil yo te transfekte ak yon melanj de 2 mg nan vektè a SPACA6 pMT-puro ak reyaktif transfè Effectene (Qiagen) dapre pwotokòl manifakti a.Selil transfekte yo te enkube pou 72 èdtan ak Lè sa a, rekòlte ak 6 mg / ml puromicin.Lè sa a, selil yo te izole nan mwayen konplè Schneider a epi yo mete yo nan medyòm Insect-XPRESS serom gratis (Lonza) pou pwodiksyon pwoteyin gwo echèl.Yon pakèt 1 L nan kilti selil S2 te grandi nan 8-10 × 106 ml-1 selil nan yon 2 L vantile polypropylène Erlenmeyer flacon ak Lè sa a, esterilize ak yon konsantrasyon final nan 500 µM CuSO4 (Millipore Sigma) ak esteril filtre.pwovoke.Kilti pwovoke yo te enkube nan 27 ° C nan 120 rpm pou kat jou.
Mwayen kondisyone ki gen SPACA6 te izole pa santrifujasyon nan 5660 × g nan 4 ° C ki te swiv pa yon Centramate sistèm filtraj tanjansyèl koule (Pall Corp) ak yon manbràn 10 kDa MWCO.Aplike mwayen konsantre ki gen SPACA6 nan yon kolòn 2 ml Ni-NTA agarose résine (Qiagen).Ni-NTA résine a te lave ak 10 volim kolòn (CV) nan tanpon A ak Lè sa a, 1 CV nan tanpon A te ajoute pou bay yon konsantrasyon final imidazol nan 50 mM.SPACA6 te eliye ak 10 ml tanpon A konplete ak imidazol nan yon konsantrasyon final 500 mM.Yo te ajoute tronbin klas restriksyon (Millipore Sigma) dirèkteman nan tib dyaliz la (MWCO 12-14 kDa) nan 1 inite pou chak mg SPACA6 vs 1 L 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 ak 150 mM NaCl (tanpon B) pou dyaliz.) nan 4 ° C pou 48 èdtan.Lè sa a, thrombin-cleaved SPACA6 la te dilye twa fwa pou diminye konsantrasyon sèl epi chaje sou yon kolòn echanj kasyon MonoS 5/50 GL 1 ml (Cytiva/GE) ekilibre ak 10 mM Tris-HCl, pH 7.5.Yo te lave echanjeur kasyon an ak 3 CV nan 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, Lè sa a, SPACA6 te eliye ak yon gradyan lineyè nan 0 a 500 mM NaCl nan 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 pou 25 CV.Apre chromatografi echanj iyon, SPACA6 te konsantre a 1 ml ak eluye izokratik nan yon kolòn ENrich SEC650 10 x 300 (BioRad) ekilibre ak tanpon B. Dapre chromatogram, pisin ak konsantre fraksyon ki gen SPACA6.Pite te kontwole pa elektwoforèz Coomassie-tache sou yon jèl 16% SDS-polyacrylamid.Konsantrasyon pwoteyin yo te quantifye pa absòbe nan 280 nm lè l sèvi avèk lwa Beer-Lambert ak koyefisyan teyorik molè disparisyon an.
Pirifye SPACA6 te dyalize lannwit lan kont 10 mM fosfat sodyòm, pH 7.4 ak 150 mM NaF ak dilye nan 0.16 mg / mL anvan analiz pa espektroskopi CD.Yo te kolekte optik espektal CD ak yon longèdonn 185 a 260 nm sou yon espektropolarimèt Jasco J-1500 lè l sèvi avèk kivèt kwatz ak yon longè chemen optik 1 mm (Helma) nan 25 ° C nan yon vitès 50 nm / min.Spectre CD yo te korije debaz yo, yo te fè yon mwayèn sou 10 akizisyon, epi yo te konvèti an mwayèn eliptik rezidyèl (θMRE) an degre cm2/dmol:
kote MW se pwa molekilè chak echantiyon nan Da;N se kantite asid amine;θ se elipsite an milidegre;d koresponn ak longè chemen optik la an cm;konsantrasyon pwoteyin nan inite yo.